химический каталог




Лабораторный практикум по технологиям ферментных препаратов

Автор И.М.Грачева, Ю.П.Грачев, М.С.Мосичев, Е.Г.Борисенко и др.

фермента и условий определения. Поскольку для получения надежных значений кинетических параметров необходимо измерять окорость реакции как при [S]0/(м, в данном разделе работы следует выбрать диапазон варьирования концентрации субстрата в рабочем растворе от 2- Ю-4 до 2-;10-3М (2НШ-4, 4-10-', 6-Ю-4, НЮ-3 и 2|-Ш-3М). Использование более высоких концентраций субстрата может приводить к отклонениям от уравнения Михаэлиса—Ментен за счет ингибирования щелочной фосфатазы избытком субстрата.

Основной исходный раствор n-НФФ готовится растворением точной навески га-НФФ в 10 (для варианта метода А) или 25 см3 (для варианта метода Б) буфер-но-солевого раствора так, чтобы концентрация «.-НФФ в нем составляла 0,02 М. Раствор стабилен несколько дней при хранении в холодильнике.

Данные спектрометрического анализа заносят в протокол наблюдений, который имеет следующий вид:

Количество прогидролизованного субстрата в отдельные моменты времени от начала реакции, мин

Концентрация субстрата в рабочем растворе, М

№ параллельных определений

27

30

•Среднеарифметическое Границы достовер-«ых отклонений

Снятие характеристик процесса при изменяющейс! концентрации субстрата. Эта часть работы проводит для определения констант Михаэлиса (VWix, /См). Пост новка эксперимента аналогична той, что дана в перв< части работы. Серия опытов (3—5 повторностей) пров дится при варьировании концентрации субстрата [S]o соблюдении на стабильном уровне всех остальных уел вий проведения реакции гидролиза (рН, температур длительность инкубации, дозировка фермента и т. ДПри проведении каждой серии опытов определяет! соответствующая скорость реакции v, на основании п лученных данных строится кривая Михаэлиса. В идеал ном случае экспериментальные точки должны охват! вать все участки кривой: начальный, линейный, коне-ный при p=Kmax = const и промежуточный.

358

2и т. д.

Для щелочной фосфатазы влияние рН реакционно!": среды изучается в сравнительно узких пределах: от 7 до 10, так как оптимальный для действия фермента рН .лежит выше 8,7, однако при использовании среды рН>9,6—10,0 возможно искажение результатов за сч явления щелочного гидролиза п-НФФ.

Влияние концентрации фермента на скорость фс ментативной реакции изучается, исходя из предполаг;.. мой скорости образования продукта реакции. Поскольку максимальная точность спектрофотометрического определения достигается при Д?><0,8 (в диапазоне 0,2— 0,8), в соответствии с формулой (2) концентрация продукта реакции [Р] в ходе эксперимента должна меняться от 0 до — 4,5-Ю-5 М при работе в кювете (метод А) и от 0 до ~4-10_4М при работе методом аликвотньп проб (метод Б). С другой стороны, оптимальное время определения одной кинетической кривой составляет 15-30 мин, что в пересчете на желательную скорость превращения субстрата составляет -~2-l0~3 мкмоль/(см3Х Хмин) по методу А и ~1-10~2 мкмоль/(смэ-мин) по методу Б. В обоих случаях за время опыта достигается превращение от 1 до 15% субстрата, что позволяет пренебречь изменением его концентрации, т. е. можно считать, что получаемый участок кинетической кривой прямолинеен.

Поскольку за единицу активности фермента принимается такое его количество, которое катализирует пре' вращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин, скорости соответствуют содержанию фермента 0,002 ед. ФА/см3 и 0,01 ФА/см3. Наиболее распространенные препараты щелочной фосфатазы имеют активность 0,3—0,7 ед./мг белка, следовательно, концентрация белка в рабочем растворе должна составлять 0,004—0,008 мг/см3 и 0,02—0,05 мг/мг белка соответственно.

Основной раствор фермента готовится растворений1 точной навески фермента в 2—10 см3 буферно-солев!"гЛ раствора с рН 9 с таким расчетом, чтобы концентрат белка в нем составляла 1 мг/см3 (активность 0,3—0,5^ ФА/см3); такой раствор стабилен в течение суток. Р-', творы для более долгого хранения готовятся в 0,01 -трис-буфере (см. приложение II) с рН 8,0, содержа1Яе; 10~2—10_3М MgCl2, и хранятся при температуре Ш1* — 10°С.

160

Результаты снятия кривых скорости ферментативной реакции в зависимости от концентрации фермента, рН среды (в диапазоне 7—10), температуры (от 25 до 40°С), содержания в среде Mg2+ и неорганического фосфата заносят в протокол наблюдений, аналогичный приведенному во втором разделе работы.

При выполнении этой части работы молено провести с-днофак-торные исследования (см. приложение I, § Й) и по их результатам получить уравнения, описывающие влияние этих факторов на параметры Км и I'mai. Однако более эффективным будет многофакторное исследование, базирующееся на планах дробного или полного факторного эксперимента, позволяющее получить одно уравнение, описывающее влияние на процесс всех принятых к исследованию факторов. Это уравнение может быть также использовано для поиска оптимальных величия этих факторов по схемам, изложенным а приложении I, § 3.

Вычисление констант уравнения и построение графических зависимостей. Экспериментальные данные, занесенные в протоколы наблюдений, после статистической

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Скачать книгу "Лабораторный практикум по технологиям ферментных препаратов" (1.58Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ремонт и то чиллеров
стол складной реечный
шкаф управления bm
интернет-магазин посуды

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.04.2017)