химический каталог




Лабораторный практикум по технологиям ферментных препаратов

Автор И.М.Грачева, Ю.П.Грачев, М.С.Мосичев, Е.Г.Борисенко и др.

Это позволяет прцце! нить высокочувствительный и точный спектрофотометрц. ческий метод контроля за ходом реакции. Поскольм, в соответствии с законом Ламберта — Бэра ?> = ЕС/ (г-е D — оптическая плотность; s—• молекулярный коэффц. циент поглощения, равный для /г-нитрофенолят-ионь 18 200 л/(моль-см) при А,=400 нм; с — концентрация поглощающего свет вещества; I — толщина кюветы, чаще всего 1=1 см), степень накопления продукта реакции Ас = Д[Р] = AD/tl и скорость реакции [в мкмоль/ (см3у Хмин)] описывается уравнением

v = d[P]ldx= (AD/Дт) (103/е/). (2)

Величина AD/Ax определяется как тангенс угла наклона экспериментальной кинетической кривой в координатах р-—т. Более строго величина углового коэффициента может быть определена по методу наименьших квадратов (см. приложение I, § 1).

Для того чтобы ферментативный гидролиз шел на начальных скоростях, реакцию следует вести в разбавленных растворах субстрата и фермента. Такие растворы сложно приготовить из навески, поэтому, как правило, готовят более концентрированные растворы (основные), а из них путем разбавления — рабочие растворы требуемой концентрации.

Для щелочной фосфатазы реакцию следует вести при рН 9,0 в 0.05М. карбонатном буфере с ионной силой 1,0. Его готовят путем смешивания 45,9 см3 1 М водного раствора бикарбоната натрия, 4,1 см3 1 М водного раствора карбоната натрия, 942 см3 1 М водного раств pa NaCl и 8 см3 воды. Вода для приготовления буфе} должна быть дистиллированной, не содержащей йот меди и других тяжелых металлов.

Если активность препарата неизвестна, ее необход мо определить экспериментально. Для этого использун один из методов (А или Б), приведенных ниже, но ко центрация субстрата в рабочем растворе должна соста лять (4—5)10_3М. Скорость, вычисленная при этом i формуле (2), соответствует активности фермента (в е ФА/см3). Зная концентрацию белка (в мг/см3), вычн ляют активность исходного препарата фермента (в е ФА на 1 мг белка).

Измерение скорости гидролиза /г-нитрофенилфосфата в кювете спектрофотометра непрерывным способом (метод А), 0,1 —1,0 см3 основного раствора субстрата (концентрация 0,02 М) разбавляют буферно-солевым раствором до общего объема 10 см3. Необходимые количества полученного раствора (для кювет с толщиной слоя 1 см 3,5—4,0 см3) вносят в контрольную и рабочую кюветы спектрофотометра, которые помещают в термоблок, установленный в кюветной камере. После термо-статирования в течение 5—10 мин при 25°С в рабочую кювету микропипеткой вносят 0,02—0,04 см3 основного-раствора фермента с таким расчетом, чтобы активность фермента в кювете составляла (2—3)10—3 ед./см3 (для обычных препаратов щелочной фосфатазы это соответствует по массе концентрации 0,004—0,008 мг/см3). Одновременно с введением фермента пускается секундомер— этот момент времени принимается за нулевой. Кювету быстро встряхивают и вновь помещают в термоблок. Через определенные промежутки времени (2— 4 мин в зависимости от концентрации субстрата) в течение 15—25 мин (6—8 измерений) фиксируют оптическую плотность D раствора в рабочей кювете при А,= = 400 нм. Результаты замеров записывают в протоколе наблюдений, они служат исходными данными для расчета скорости реакции v по уравнению (2) и для построения кривой 1в координатах D—г.

Измерение скорости гидролиза п-нитрофенилфосфата методом аликвотных проб (метод Б). 0,25—2,5 см3 основного раствора субстрата (концентрация 0,02М) разбавляют буферно-солевым раствором в мерной колбе на 25 см3. Колбу термостатируют 5—10 мин при 25°С и Доводят до метки тем же раствором. 0,7 см3 полученного раствора субстрата разбавляют 5 см3 0,1 н. раствора NaOH и вносят в контрольную кювету (если в течение опыта в контрольной кювете будет наблюдаться по-*елтение раствора, надо вместо раствора субстрата поместить в нее буферно-солевой раствор без субстрата, Разбавленный в 5 раз 0,1 н. раствором NaOH). Затем 8 колбу вносят 0,5—1,0 см3 основного раствора фермен-Та с таким расчетом, чтобы его активность в колбе со-СтавЛяла (1— 2) 10-2 ед./см3 (0,02—0,05 мг/см3), быстро Отряхивают колбу и пускают секундомер. Через определенные промежутки (3—5 мин в зависимости от кон156

15Г

центрации субстрата) в течение 20—30 мин (6—8 раз, отбирают аликвотные пробы объемом 0,5 см3 (при Ss=10-3) или I см3 (при [So]<10-3 М), которые вливают в колбы с 5 см3 0,1 н. раствора NaOH для остановки реак-ции. Полученный раствор переносят в рабочую кювету и определяют оптическую плотность при Я, = 400 нм. Ре. вультаты замеров в нескольких параллельных определениях заносят в протокол наблюдений, данные обрабатывают статистически (см. приложение I, § 1); они служат исходными данными для расчета скорости реакции по уравнению (2) и для построения кривой в координатах D—т.

параллельных опытов

Время от начала реакции, мин

Протокол наблюдений по этой части работы имеет следующий вид:

Количество прогидролизован-ного субстрата или накопившегося продукта реакции

Известно, что Км для субстрата и-НФФ лежит в пределах от ЗЛО-1 ДО Ы0~3М в зависимости от происхождения

страница 56
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Скачать книгу "Лабораторный практикум по технологиям ферментных препаратов" (1.58Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
wmn.636x.128.m00d1
реклама на мобильных устройствах плюсы и минусы
V1A91EA
капитанская дочка спектакль в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(19.08.2017)