химический каталог




Лабораторный практикум по технологиям ферментных препаратов

Автор И.М.Грачева, Ю.П.Грачев, М.С.Мосичев, Е.Г.Борисенко и др.

н и устанавливают нужную скорость протекания раствора. В момент входг последней порции материала в гель кран перекрывают и внутренние стенки омывают минимальным количест вом элюента. После прохождения этой порции добавляют большое количество элюента и колонку соединяют с резервуаром.

Фракции, отбираемые с колонки, можно в дальнейшем объединить в соответствии с кривой оптической плотности элюента при 1 = 280 нм, полученной на «Увн-корде» или на спектрофотометре. После элюции колонку отмывают не менее чем двумя объемами буфера.

Регенерация колонки. Эта операция осуществляется простым пропусканием через колонку любого растворителя или (при необходимости удаления механических примесей, попавших в нее в процессе работы) отмучива-нием. Частые перебивки колонки с гелем нецелесообразны, правильно заполненная колонка может быть использована 5—10 раз.

Очень часто в колонках после завершения цикла очистки нарушается правильная укладка верхнего слоя,

150

особенно в случае мелкозернистых и крупнопористых частиц. Если размеры повреждения не слишком велики, то можно внести в колонку 0,5—1,0 см3 свежего геля и взмутить столб на глубину 2—3 см.

При длительной работе колонок желательно добавление к пропускаемым растворам антисептиков, таких как хлороформ, толуол, крезол, 0,001 %-ный раствор тио-мертполата, 0,02%-ный раствор NaN3 и т. п. Использование грыс-буфера обеспечивает нормальную работу колонок в течение длительного времени.

Анализ полученных фракций. Собранные фракции после измерения их оптической плотности используют для определения ферментативной активности (двух и более ферментов).

Построение хроматограммы. В случае отсутствия «Увикорда» можно после замера оптической плотности (?>28о) и определения ферментативной активности во всех фракциях построить хроматограмму, По оси ординат откладывается оптическая плотность; по оси абсцисс — номера фракций. На этом же графике строится зависимость ферментативной активности от номера фракции. По совмещенному графику можно судить о степени разделения комплекса ферментного препарата при данных условиях гельфильтрации.

Третье занятие

На этом занятии студенты калибруют колонку и определяют молекулярную массу фермента.

Калибровать колонку нужно в том случае, если требуется при помощи гельфильтрации определить молекулярную массу неизвестного соединения. В качестве стандартов используют белки, молекулярная масса которых известна, например бычий сывороточный альбумин, бычью рибонуклеазу и бычий углобулин. Готовят растворы соответствующих белков, содержащие 10 мг белка в 1 см3. К раствору каждого белка в качестве марке-Ра прибавляют небольшое количество фенолового красного. В колонку вводят 2,5 см3 этого раствора (25 мг белка) и при помощи спектрофотометра определяют содержание белка в соответствующих фракциях. Полученные результаты используют для построения калибро-вочной кривой, откладывая по оси ординат логарифм Молекулярной массы белка, а по оси абсцисс — номера

151

соответствующих фракций. В основе данного метода определения молекулярной массы лежат данные Вита-кера о том, что между логарифмом молекулярной массы указанных выше белков и объемом, в котором они элю-ируются из данной колонки, существует прямая зависимость.

При пропускании через колонку неизвестного белкового соединения определяем объем, в котором оно элюн-руется. Затем по калибровочной кривой можно определить его молекулярную массу.

Определение молекулярной массы неизвестного соединения является ответственной задачей, выполнить которую можно, лишь осуществив несколько повторностей опыта (>3), используя полученные результаты для отбраковки грубых ошибок и определения доверительных ошибок (см. приложение I, § 1).

После проведения испытаний составляют протокол наблюдений, включающий характеристику ферментного препарата (его активность, содержание белка, объем пробы, нанесенной на колонку), характеристику колонки (ее диаметр и высоту, марку сефадекса, скорость протекания буферного раствора), результаты анализа полученных фракций (активность в ед./см3 и содержание белка в мкг/см3), хроматограмму и калибровочную кривую.

Лабораторная работа №11 Исследование кинетики ферментативной реакции

Кинетическое исследование представляет собой один из важнейших этапов исследования ферментов, дающих ценные сведения о строении ферментов, их активных центрах и механизме их действия. Эти исследования необходимы для грамотного использования ферментов.

Характеристика кинетики изучаемого фермента складывается из нескольких показателей. Прежде всего определяется скорость ферментативной реакции, которая представляет собой производную d[C]ldx, где [С] — концентрация исходного субстрата, на который действует фермент, т — время.

Если определение проводится при постоянных внешних условиях (температура, давление, растворитель и т. д.), то скорость реакции описывается уравнением

152

v = klAfAlB]n*, (1)

где А и В— изменяющиеся при реакции соединения (квадратные скобки показывают, что речь идет о концентр

страница 54
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Скачать книгу "Лабораторный практикум по технологиям ферментных препаратов" (1.58Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы ремонт кондиционеров краснодар
купить сетки для щитков найк в самаре
урна уличная уп-2
сетка сварная прайс лист

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.04.2017)