химический каталог




Лабораторный практикум по технологиям ферментных препаратов

Автор И.М.Грачева, Ю.П.Грачев, М.С.Мосичев, Е.Г.Борисенко и др.

градиента можно объяснить еле дующим образом. В растворе любого электролита в электрическое пола у катода и аиода соответственно будут накашиваться, на пример, КОН и H2SO4. Если к раствору добавить какой-либо орав нительно низкомолекулярный амфолит типа смеси пептидов, то ; отрицательно заряженного катода в основной среде пептид приоб ретет отрицательный заряд, а у положительно заряженного анод*5 в кислой среде заряд пептида станет положительным. Поэтому пеп тиды будут отталкиваться от близлежащего электрода к центр) камеры или колонки до тех лор, по.ка не займут такого положения в котором их общин заряд будет равен величине рН электролита Боли в системе будет присутствовать смесь пептидов, различаю-щихся по величине и знаку заряда, то они будут располагаться в соответствии с величинами их изоэлектричеоких точек: наиболее ооновные пептиды вблизи катода, наиболее кислые — вблизи анодя.

142

пептиды с промежуточными изоэлекгрическими точками — между этими крайними полюсами. Таким образом, в результате электро-форетического процесса возникает естественный градиент рН, стабильный и неподвижный в течение длительного времени, пока к системе приложена разность потенциалов.

Решающую роль в этой системе играют амфотерные электролиты, предназначенные для создания естественного градиента рН. Такую роль могут выполнять только такие амфотерные электролиты, которые обладают хорошей буферной емкостью и хорошей проводимостью в области своих изоэлектричетасих точек. Кроме того, эти вещества должны обладать сравнительно небольшой молекулярной массой, чтобы быстрее достигалось равновесие и они легко отделялись диализом, и быть инертными по отношению к исследуемым объектам.

Фирма LKB производит целую серию таких амфотерных электролитов (торговое название Ampholin—амфолмн), представляющих собой алифатические аминожарбоновые кислоты, строение которых можно представить следующей формулой

~СН2—N—(CHj)*—N—СН2—

I I

<СНгЬ R

NR

где х=2 или 3; k=H или — (СНа)*—СООН.

Изоэлектрические точки амфолинов покрывают интервал рН от 3,0 до 10,0, а также любой из более узких интервалов в этом диапазоне. Молекулярная масса различных амфолинов лежит в, пределах 303—йСЙ, они легко удаляются диализом и обладают низкой величиной светопоглощения при Х=2№ нм.

Разрешающая способность метода с имеющимися в продаже амфолинами равна 0;02 ед. рН, что дает возможность разделять вещества, изоэлектрические точки которых различаются между собой на указанную величину.

Недостатком метода является необходимость работать в бессолевой среде, что в ряде случаев может способствовать инактивации ферментов. Кроме того, в изоэлектрической точке, особенно при высокой локальной концентрации, многие белки выпадают в осадок. Частичное уменьшение растворимости в изоиопном состоянии можно компенсировать добавлением мочевины (до 2.—4 М), если только мочевина сама по себе не оказывает денатурирующего действия.

Фирма LKB выпускает специальные колонки для работы по описанному методу вместимостью ПО и 440 см3 (рис. 19). В центре колонки по ее длинной оси расположен электродный сосуд в форме трубки с вентилем ка его нижнем конце. Вентиль открывается и закрывается с помощью специального регулятора в верхней части электродной трубки. Регулятор и вентиль соединены тефлоновым стержнем, на который намотана плати143

к

новая проволока, служащая одним из электродов (катодом). Второй платиновый электрод (анод) помещается в верхней части колонки так, что анодное и катодное отделения сообщаются при открытом вентиле. Нижний конец колонки закрыт тефлоно-вой насадкой с капилляром, через который колонка после окончания фракционирования опо рожняется.

Целью настоящей работы яв ляется разделение комплекса ферментов в соответствии с т изоэлектрическими точками. Работа проводится в два занятия.

Рис. 19. Аппарат для изоэлектрофоку-сирования в градиенте плотности: / — электродный сосуд; 2 — тефлоновый стержень с электродом; 3 — насадка с капилляром

Первое занятие

На первом занятии проводят изоэлектрофокусирова-ние ферментов в градиенте плотности сахарозы.

Эксперимент с изоэлектрическим фокусированием на колонке описанного типа ставят следующим образом. Вначале готовят два раствора: тяжелый и легкий. Первый (60 см3) содержит 0,75 г амфолина, покрывающего нужный диапазон рН, и 28 г сахарозы, растворенных в дистиллированной воде. Второй раствор (60 см3) содержит 0,25 г амфолина. Исследуемое вещество добавляют к легкому раствору. Порядок добавления зависит от того, как будет создаваться стабилизирующий градиент плотности сахарозы. При непрерывном градиенте, создаваемом в смесителе, образец суспендируется во всем объеме легкого раствора. Если создается ступенчатый градиент путем смешивания в определенной пропорции обоих растворов, то образец суспендируется в последней порции легкого раствора, наслаиваемой последней на верх колонки. В случае, когда исследуемый белок

144 находится в растворе, соответствующий объем этого раствора приливают к легкому раствору.

Приготовл

страница 51
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

Скачать книгу "Лабораторный практикум по технологиям ферментных препаратов" (1.58Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.02.2017)