алитических целей используют трубочки диаметром 'о0 мм, для препаративных — диаметром 120 мм. При-°Р в процессе электрофореза закрывается крышкой, к которой подсоединен автоматический выключатель. Выключатель с помощью соединительных проводов подсо-Динен к источнику питания при стабилизированном на-Ряженин. В случае поднятия крышки прибора, находя139

а — прибор в сборе (Л 2 — сосуды для электродных буферов- 3 — тр. бочки длиной 120 мм; 4 — трубочки длиной 100 мм; 5 — электрод-дери,, тель; 6 — соединительные ножки; 7 — уплотняющая система с автомат, ческим выключателем); 6 — штатив для трубочек прибора (1 — уплотяя щая гайка; 2 — прокладочное кольцо; 3 — резиновое кольцо-прокладк

щегося в рабочем состоянии, выключатель автоматически отключает прибор от источника питания.

Для стеклянных трубочек прибора, имеющих ра, ? ный размер, прилагаются два разливочных штатив (см. рис. 18,6), представляющих собой пластинку резьбовыми углублениями. Стеклянные трубочки в пластинке закрепляются во время проведения полимеризи-ции геля с помощью уплотняющей системы в порядк-огшсанном выше.

При разделении ферментного препарата с помощь4-' диск-электрофореза -студенты проводят следующие от рации:

определяют содержание белка в ферментном препарате и готовят раствор для электрофореза; готовят гели и буферный раствор; проводят электрофорез; окрашивают белковые зоны;

определяют ферментативную активность в белковьН фракциях.

140

Определение содержания белка в ферментном препарате и приготовление раствора для электрофореза. Содержание белка в препарате определяется модифицированным методом Лоури. На основании данных о процентном содержании белка в ферментном препарате готовят пробу для испытания. В пробе с 5%-ным содержанием сахарозы должно быть 50—100 мкг белка, а ее объем не должен превышать 0,1 см3.

Приготовление гелей и буферного раствора. Гели и электродный буферный раствор готовят по прописи, приведенной в табл. 8 приложения II. Обычно 7,5%-ный полиакриламидный гель оказывается пригодным для электрофоретического разделения белковых компонентов многих ферментных препаратов. С целью проверки полноты разделения белкового комплекса необходимо поставить проверочные опыты с концентрацией акриламида в пределах 3,45—15%.

Проведение электрофореза. После нанесения испытуемой пробы на поверхность геля стеклянные трубочки устанавливают в гнезда прибора для электрофореза. В верхний И нижний резервуары наливают буферный раствор, после чего электроды подключают к источнику постоянного тока. Окончание процесса электрофореза определяют по моменту, когда полоска бромфенолового синего в контрольной трубочке подойдет к нижнему ее краю.

Окрашивание белковых зон. Гель извлекают из трубки и переносят в широкий химический стакан вместимостью 400—600 см3. В стакан наливают раствор красителя (амидовый черный 10В; процион бриллиантовый синий RS; кумаси бриллиантовый синий R250). Периодически перемешивая, гель выдерживают в красителе от 0,5 до 2 ч. Затем раствор красителя сливают и отмывают избыток красителя 7%-ным раствором уксусной кислоты. Отмывание — длительный процесс, требующий многократной смены раствора уксусной кислоты, но так как в работе не предусмотрено денситометрическое определение, можно не добиваться полного удаления фона.

Определение ферментативной активности в белковых Фракциях. На ровной поверхности параллельно друг ДРУгу располагают окрашенный и неокрашенный гель с одинаковым испытуемым образцом. Из неокрашенного теля вырезают фрагменты, соответствующие окрашен141

ным зонам геля. Отдельные кусочки гомогенизируют ;?. соответствующем буфере, и в элюатах определяют а\ тивность фермента.

При выполнении этой работы в виде самостоятельной Н№ необходимо проводить опыты не менее чем в трех повторностг-, что позволяет выявить возможные грубые ошибки в экспериме тальных данных и рассчитать величины доверительных ошибок п лученных средних результатов (ом. приложение I, § 1).

В качестве дополнительного задания может быть поставлю (Задача определения оптимальных условий электрофореза. В этс Случае следует применить математические методы планирован! ^ногофакторных исследований (см. приложение I, § 3) с последу! щим поиском оптимальных .условий.

Протокол наблюдений по данной работе додже включать описание (характеристику) исходного фе| ментного препарата на содержание белка по активш стям ферментов и системы геля; объем и количестг белка в испытуемой пробе; подробное описание услови электрофореза (температура, сила тока, накладываема на гель, длительность и т. д.); рисунок трубки геля окрашенными белковыми фракциями; схему разрезани столбика геля; данные по активности фермента или фег ментов в отдельных фракциях, сведенные в таблиц}

Лабораторная работа № 9

Изоэлектрическое фокусирование белков

Метод изоэлектрического фокусирования позволяем разделить белки, различающиеся своими изоэлектриче скими точками. В данном методе используется так на зываемый естественный градиент рН.

Механизм образования такого