химический каталог




Технология ферментных препаратов

Автор И.М.Грачева

самых различных приемов: осаждение и фракционирование органическими растворителями, солями, хроматографию на молекулярных ситах и ионообменную хроматографию, электрофорез и др.

Аффинная хроматография. Остановимся подробнее на одном из перспективных способов — аффинной хроматографии. Еще в 1973 г. И. Н. Канфером была проведена аффинная хроматография целлюлаз, в результате чего на сефарозе 4В со связанным бензидином в качестве носителя и б-глюконолактоном в качестве лиганда была выделена целлобиаза. Позднее С. Гонг путем хроматографии на конканавалин-Л-агарозе на металлопротеиновой подложке отделил целлобиазу от эндоглюкаиазы. Детальное исследование адсорбции целлюлаз на различных аффинных лигаи-дах было проведено и опубликовано в 1977 году Т. Мега и И. Мат-зухима Наибольший интерес представляют собой исследования по аффинной хроматографии целлюлаз на микрокристаллической целлюлозе или целлюлозе в виде измельченной порошкообразной фильтровальной бумаги. Использование целлюлозы позволяет разделить целлюлазный комплекс на основе различной степени сродства компонентов к субстрату.

Такая работа для препаратов целлобраиина Г10Х и целловирндииа ГЗх была проведена В. А. Мартьяновым, М. Л. Рабиновичем, А. А. Клесовын и др. (1983). В качестве носителей применялись следующие формы целлюлозы: порошковая и микрокристаллическая целлюлозы, иеизмельчеииая вата, измельченный и иеизмельчениый хлопковый лнит. Аффинную хроматографию проводили в колонках, заполненных носителем. Адсорбция ферментов проводилась при температуре 4—10 °С и рН 4,5 (оптимальный дли действия целлюлаз) в 0,1 М ацетатном буфере. Десорбцию ферментов осуществляли путем изменении рН элюеита до 7,0 (0,1 М фосфатным буфером) и последующего понижении ионной силы элюирующего буфера до 0.010—0,001 М и далее дистиллированной водой. Отбираемые фракции элюента анализировались на содержание белка и активность. Результаты этих опытов представлены иа рнс. 2.31.

В оптимальных условиях иа первой [А) стадии происходит адсорбции ферментов из раствора с одиовремеииой очисткой их от балластных примесей и пигментов. На этой стадии сорбнруетсн до 90—95 % эндоглюкаиазы. Далее колонку отмывают 0,1 М ацетатным буфером с рН 4,5 до прекращения выхода белка и пигментов. На второй стадии (Б) при промывании колонки 0,1 М фосфатным буфером с рН 7 происходит дополнительное отделение балластных белков, так как ферментативной активности практически не обнаружено. Третья стадии (В, Г и Д) —это элюция адсорбированных ферментов с колонки фосфат213

с носителя („о д^ым вТ^Ж Л Рабиновича^^rf ftSJ,*"™

гидролизе хлопка (мкМ. хл)- 5 - «они?? 71 <",<м); *_ образование глюкозы пои

ацетатные буфер (оН 451- к п, "?"«•" сила (а относительных единицах)- лii, и

Ш ,РН % 'лад» ai^^t^ r/oiiHjep

ным буфером с рН 7—7,2 с понижением его ионной силы. По мере снижения ионной силы буфера происходит десорбция различных количеств эидоглюканазы с колонки, что свидетельствует о той, что система ферментов многокомпонентна и отличается различной адсорбционной способностью на целлюлозе. Известно, что целлобногидролаза более прочно сорбируется на целлюлозе, чем эндоглю-каназа. Поэтому ее элюция возможна при низких значениях ионной силы. В связи с этим последний этап элюции, .несмотря иа ухудшение гидродинамических свойств носителя, проводили дистиллированной водой.

Полученные фракции проверяли иа способность гидролизовать иативный

хлопок. Чтобы проследить за гидролизом, в реакционную смесь вводили нэбым ток очищенной целлобназы с тем,

3-сил*

ДО чтобы была возможность характе-ризовать процесс по глюкозе. Из рис. 2.31 (кривая 4) видно, что все фракции, обладающие эндо-глюканаэкой активностью, способны гидролизовать иативную упорядоченную целлюлозу (хлопок). Фракции, выходящие последними при элюции дистиллированной водой или при длительной отмывке 0,001 М фосфатным буфером с рН 7, обладали более высокой гидролнзуюшей активностью. Эти опыты показали, что аффинная хроматография на целлюлозе позволяет выделить комплекс целлюлаз Т. longibrachiatum, очистив его от сопутствующих белков и пигментов, на ие дает возможностей для разделения комплекса иа отдельные ферменты, т. е. этот метод эффективен для групповой очнсткн целлюлаз.

Анализ процесса элюции целлюлаз, представленного иа рис. 2.31, показывает, что можно упростить и заменить многоступенчатую элюцню одноступенчатой элюцией 0,001 М фосфатным буфером (рис. 2.32). Из рисунка видно, что ферменты выходят острым пиком в небольшом объеме, что снимает необходимость в дополнительном концентрировании. Фракция ферментов практически не содержит кизкомолекулярных веществ и солей, а элюат содержит некоторое количество глюкозы и целлобнозы, которые способствуют стабилизации ферментов при хранении.

Аффинная хроматография позволяет получать высокоочищенные целлюлазные комплексные препараты с выходом активности до 50 % непосредственно нз фильтрата культуральной жидкости.

Однако микрокристаллическая целлюлоза является не очень хорошим носителем, у нее мал

страница 87
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141

Скачать книгу "Технология ферментных препаратов" (3.32Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Рекомендуем приобрести в КНС цифровые решения - купить windows 7 цена - корпоративные поставки по всей России.
защитные голени комперделл в москве
купить светодиодные лампы н11
фанкойлы канальные

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.04.2017)