тное отклонение, %

1 9,36 0,084

2 10,10 0,078 0,90

3 11,40 0,088 0,77

4 13,14 0,096 0,77

5 14,24 0,108 0,73

6 14,80 0,106 0,76

7 17,30 0,106 0,61

8 21,62 0,154 0,71

4 - см. рис 7-45; 6 - п - 6.

Рнс. 7-45. Хроматограмма разделения многоядерных ароматических углеводородов с применением градиентного элюирования. Колонка 1,5 мм (внутр. диам.) х 250 мм; неподвижная фаза S Finepak SIL Cjg; исходный элюент ацетонитрил/вода (50/50), конечный элюент ацетонитрил (100%); объемная скорость 150 мкл/мин; резервуар - трубка из нержавеющей стали 7,2 мм (внутр. диам.) х 50 мм.

10 15 20 Время, jnu/t

Пики: / - нафталин, 2 -бифенил, 3 - флуорен, 4 -антрацен, 5 - пирен, б - три-фенилен, 7 - хризен, 8 -бенз(а)пирен. Воспроизводимость анализа иллюстрируется табл. 7-2.

204

Применение микромасштабной ВЭЖу

Рис. 7-46 - 7-48 иллюстрируют разделения различных смесей, полученные в режиме градиентного элюирования [31].,На рис. 7-46 представлена хроматограмма Kakkonto - традиционного японского лекарственного средства, приготавливаемого из трав. Разделение проводилось на полумикроколонке внутренним диаметром 1,5 мм. В лекарственной траве содержится множество компонентов, и осуществить их полное разделение можно только методом ВЭЖХ с градиентным элюиров*анием,

и

JSS.

кJ 1 1 и

20 30

Время, мин

Рис. 7-47. Разделение компонентов сапонина. Колонка та же, что и на рис. 7-46; исходный элюент ацетонитрил/0,1%-ная фосфорная кислота (10/90), конечный элюент ацетонитрил/0,1%-ная фосфорная кислота (70/30); объемная скорость 150 мкл/мин; детектор УФ, 220 нм; проба водный раствор смеси, содержащей сапонин (10 мг/мл); объем пробы 1,0 мкл.

На рис. 7-47 изображена хроматограмма компонентов сапонина, применяемого в качестве отхаркивающего средства. И наконец, на рис. 7-48 представлена хроматограмма фенольной смолы. Обычно такого рода анализы проводят методом эксклю-зионной хроматографии, однако, если необходима более детальная информация о низкомолекулярных компонентах, целесообразнее прибегнуть к обращенно-фазовому методу. Правда, при этом высокомолекулярные компоненты фенольной смолы сильно удерживаются колонкой, и для полного их удаления необходимо градиентное элюирование. В рассматриваемом эксперименте низкотемпературные компоненты смолы разделены с

Применение миквомасштабной ВЭЖх

Применение миквомасштабной ВЭЖХ

Ж

го

время, мин

высокой эффективностью, а высокомолекулярная фракция элю-ировалась за приемлемое время.

Опубликовано несколько работ, посвященных методу гра~ диентного элюирования со смешиванием при высоком давлении при помощи двух насосов [28, 32-35]. Скотт и Кучера [34] исследовали основные характеристики такой системы и описали ряд примеров ее применения. Так, на рис. 7-49 представлена хроматограмма, полученная при анализе проб сыворотки крови на длинной открытой капиллярной колонке внутренним диаметром 1 мм, изготовленной из нержавеющей стали. Шварц и сотр. [35] применили градиентное элюирование со смешиваниРис. 7-49. Хроматограммы проб сыворотки крови, полученные при разделении на капиллярной колонке, на внутренние стенки которой нанесена неподвижная фаза. Колонка 1,0 мм (внутр. диам.) х 1 м; неподвижная фаза силикагель, модифицированный С18 (размер частиц 10 мкм); исходный элюент метанол/вода (75/25), конечный элюент 100%-ный метанол, экспоненциальный градиент (кривая V(l.9 программатора состава растворителя фирмы Waters); объемная скорость 40 мкл/мин; детектор УФ, 254 нм.

и

Л

ЖПримененце ткромасципабной В1& ^ияешяше микпсмасштабной ВЭЖХ

209

0.004 ED ПОГЛ.

т

ем под давлением для анализа пептидов и белков. На рис. 7-50 показаны две из полученных этими авторами хроматограмм. Смеси ряда пептидов и гидролизата инсулина разделяли на микроколонке. 35 см х 1 мм (внутр. диам.).

В 7.

7.3.4. Сочетание полумикро-ВЭЖХ и масс-спектрометрии

Мы подробно исследовали возможность сочетания полумикро-ВЭЖХ и масс-спектрометрии (МС). Обычно в полумикро-ВЭЖХ используются колонки внутренним диаметром 1,5 мм при объемной скорости порядка 100 мкл/мин. При сочетании полумикро-ВЭЖХ и МС поступающий из колонки элюат обычно делится в отношении 70:30 - 90:10 и 30 - 10% элюата подается с помощью специального переходного устройства в масс-спектрометр. Авторы настоящей главы использовали для подключения колонки вакуумный распылитель, разработанный Т. Цуге и описанный ранее в гл. 5 (разд. 5.2.).

0,004 ЕД. ТЛЯ

Ю

го

ВРЕМЯ, МИМ

30

Рис. 7-51. Масс-фрагментограм-ма компонентов, содержащихся в коммерческом лекарственном препарате. Колонка 1,5 мм (внутр. диам.) х 25 см; неподвижная фаза /AS Flnepak SIL Cjg (10 мкм); подвижная фаза метанол/вода (90/10); объемная скорость 70 мкл/мин; детектор MS-100, многоканальное селективное детектирование.

Пики: 1 - ацетаминофен, [М+Н]+; 2 - зфензамид, 1м+Н)+; 3 - аллилизопропила-цетилмочевина, [М+Н)+; 4 - кофеин. [М+Н]+.

m/z 152 166

185 195

Рис. 7-50. а - разделение смеси пептидов на капиллярной колонке с применением градиентного элюиров