ной дозы.

В работе Уайта и Лоуфера [28] описано разделение антибиотиков группы цефалоспорина на колонке из нержавеющей стали внутренним диаметром 1,0 мм, покрытой изнутри стеклом и заполненной силикагелем, модифицированным группами С18. Таким способом были разделены пять антибиотиков данного класса (см. рис. 7-41). Этими же авторами проведено определение цефалоспорина в ферментативных бульонах. Благодаря высокой чувствительности полумикро-ЖХ авторам удалось предварительную обработку пробы свести к простому ее разбавлению. Уайт и Лоуфер осуществили также определение примесей в антибиотиках класса цефалоспорина с использованием метода градиентного элюирования.

Бейрам и сотр. [29] изучали разделение аминокислот методом полумикро-ВЭЖХ с УФ-детектором, позволяющим быстро изменять длину волны по дискретной циклической программе. На колонке 62 мм х 2 мм (внутр. диам.), заполненной

198

Применение миквомасштабной ВЭЖте

силикагелем, насыщенным амминным комплексом меди, они разделили 14 типов аминокислот. Эти же авторы описали определение мочевой кислоты в сыворотке крови (рис. 7-42).

7.3.3. Применение градиентного элюирования

Градиентное элюирование широко применяется в ВЭЖХ и в настоящее время является обычным аналитическим методом. Разработано два способа его осуществления: смешивание растворителей при низком давлении с последующей подачей смеси в колонку одним насосом и подача растворителей двумя насосами с последующим смешиванием их при высоком давлении. Первый способ получил в настоящее время большее распространение благодаря тому, что он дешевле и, кроме того, допускает добавление еще и третьего растворителя.

30

ю го

ВРЕМЯ,

В микро-ВЭЖХ градиентное элюирование до сих пор применялось очень редко, поскольку чрезвычайно трудно сконструировать достаточно миниатюрную градиентную установку. Что касается полумикро-ВЭЖХ, то Такахаши и сотр. [30] разработали простое устройство, позволяющее осуществить градиентное элюирование при помощи одного насоса даже при скоростях подачи элюента порядка нескольких десятых микро-литра в минуту.

На рис. 7-43 приведена блок-схема этого градиентного устройства. Оно состоит из трехходового крана-переключателя и снабженной магнитной мешалкой смесительной камеры переменного объема, рассчитанной на высокое давление. Вначале всю систему (включая смесительную камеру и колонку) промывают исходным растворителем. Далее переключают трехходовой кран, и конечный растворитель начинает поступать через смесительную камеру в колонку. В результате состав смеПрименение микромасштабной ВЭжг

Применение миквомасштабной ВЭЖХ

Сх - С, - (С, - С,) exp (-Ft/VJ

(1)

201

де?ек?оГуФ ™Tioo'01 М0ЛЬ/Л> <4/9Й: °6кша' скорость '«оТкл/S 280 и 300 нм. а - хроматограмма стандартного раствора (5 мкг мочевой кислоты в воде), б - хроматограмма 5 мкл сыворотки кровГэдорового человека *

шанного элюента, поступающего из смесительной камеры, изменяется экспоненциально до тех пор, пока исходный раство-шанного элюента, поступающего из смесительной камеры меняется экспоненциально до тех пор, пока исходный раство ритель не будет полностью заменен конечным. Изменение состава элюента описывается уравнением где С, - концентрация смешанного растворителя по прошествии времени t; Cf - концентрация конечного растворителя; С, - концентрация конечного растворителя; F - объемная скорость подвижной фазы; Vm - объем смесительной камеры; t -время. Параметры градиентного элюирования можно изменять путем соответствующего выбора концентраций исходного и конечного растворителя и объема смесительной камеры.

Рис. 7-43. Блок-схема системы градиентного элюирования для полумикро-ВЭЖХ.

1 - исходный элюент; 2 - конечный элюент; 3 - трехходовой кран-переключатель; 4 - насос; 5 - магнитный стерженек, покрытый стеклом; б - резервуар; 7 - магнитная мешалка; S - дозатор; 9 - колонка.

На рис. 7-44 изображены кривые изменения состава элюента, полученные экспериментально, а также теоретическая кривая, рассчитанная по уравнению (1). На ординату нанесены величины поглощения при 260 нм (0,32 ед. погл. на всю шкалу). При снятии экспериментальных кривых исходным растворителем служил метанол, а конечным растворителем - раствор, содержащий 0,18% ацетона в метаноле. Смесительную камеру соединяли непосредственно с проточной кюветой УФ-детектора. Из рисунка видно, что изменение состава элюента при подаче его со скоростью 200 мкл/мин начинается через 3 мин, форма экспериментальной кривой хорошо согласуется с теоретической.

На рис. 7-45. показана типичная хроматограмма, полученная на описанной установке, а в табл. 7-2 приведены данные по воспроизводимости времен удерживания, которые показывают, что относительное стандартное отклонение восьми разных ароматических углеводородов составляет менее 1%.

Применение микромасштабной ВЭЖХ

JS1

Таблица 7-2. Воспроизводимость времен удерживания при градиентном элюировании из полу -мик роколонки

Номер пикаа Среднее время удерживания, мин" Стандартное отклонение, мин Относительное стандар