179

I

ш

I

1-1

рис. 7-22. Разделение компонентов лекарственного средства ступенчатым градиентным элюнрованием. Колонка стеклянная открытая капиллярная, 52 мкм (внутр. диам.) х 4,9 м: внутренняя поверхность модифицирована химически привитым ОДС; подвижная фаза ацетоннтрил (я) и 0,05% -ный карбонат аммония (б), соотношение компонентов подвижной фазы показано на рисунке; объемная скорость 1,1 мкл/мнн; детектор УФ, 225 нм.

/О

Время, лшн

20

<5>

1-1 I

780

Применение микромасштабной ВЭХг^

(внутр. диам.), внутренняя поверхность которой модифицирована ОДС. Препарат растворяли в 10 мл 5%-ного водного рас-твора ацетонитрила и пробу (0,02 мкл) вводили в колонку.

Приборы с многоканальными детекторами имеют много' преимуществ перед обычными спектрофотометрами, работающими на одной фиксированной длине волны. В работе [18] описано применение микро-ВЭЖХ в сочетании со спектральным детектором с фотодиодной гребенкой, работающим в Уф. и видимом диапазоне, в аналогичных целях, т. е. для определения состава, лекарственного средства. На рис. 7-23 показана полученная трехмерная спектрохроматограмма. Для идентификации каждого из компонентов на рисунке достаточно сравнить его время удерживания и спектр с соответствующими характеристиками стандартного вещества. На рис. 7-24 дань" контурные графики разделенных компонентов.

ррнменение микромасштабной ВЭЖХ

дарственных средств в крови. В качестве типичного примера цожно привести определение теофиллина, часто назначаемого в качестве антиастматического средства. Теофиллин эффективен только в узком интервале его концентраций в крови, кроме того, продукты его метаболизма у разных людей бывают весьма различными, поэтому его содержание в крови необходимо контролировать у каждого пациента. Иван и сотр. [19] определяли концентрацию теофиллина в сыворотке крови методом ВЭЖХ на короткой фторопластовой микроколонке (15 см х 0,5 мм (внутр. диам.)), заполненной пористым полисти-рольным гелем с частицами размером 10 мкм. Роль внутреннего стандарта выполнял 8-хлортеофиллин. Точность определения была высокой; относительное стандартное отклонение не превышало 1%. На рис. 7-25 приведена подробная схема предварительной обработки пробы, посредством которой удается удалить из анализируемой сыворотки до 99% содержащегося в ней белка при выходе теофиллина не менее 95%. На рис. 7-26 изображена типичная хроматограмма сыворотки крови одного из пациентов.

СЫВОРО/ПКА

КРОВИ ПАЦИЕНТА

ДОДАВЯЯЮТ 2S0 МКЛ CHjOH, .СОДЕРЖАЩЕГО 8-ZB-MEO-СРИЛЛИН (FME/FOO МЛ)

СМЕШИВАЮТ

ВЫДЕРЖИБАЮТ 20 МИН ПРИ КОМНАТНОЙ . ТЕМПЕРАТУРЕ

ЦЕНТРИЩУЕИРУ/О/П FO~ МИН ПРИ 3000 ОО/МИН

_1

НАДОСАДОЧНАЯ ЖИДКОСТЬ

7.2.8. Определение теофиллина в сыворотке крови

РАЗДЕЛЕНИЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ /МКЛ ПРОБА

Высокоэффективная жидкостная хроматография имеет большое значение для определения содержания различных леРис. 7-25. Предварительная обработка пробы при определении теофиллина в сыворотке крови.

Применение микромасштабной ВЭЯ

применение микромасштабной ВЭЖХ

№

о о о

О 5 10 15

Время, мин

Рис. 7-26. Типичная хроматограмма сыворотки крови. Колонка 0,5 мм (внутр»! диам.) х 15 см; неподвижная фаза Fine GEL ПО; подвижная фаза мета*! нол/дистиллированная вода/уксусная кислота (70/30/1D; объемная скорость мкл/мин; детектор УФ, 273 нм; объем пробы 1 мкл.

Пики: I - теофиллии, 2 - 8-хлортеофиллнн (внутренний стандарт).

7.2.9. Сочетание микро-ВЭЖХ и тонкослойной хроматографии

Тонкослойная хроматография (TCX) часто используется в процессе подготовки пробы для разделения методом ВЭЖХ с целью выделения какой-либо одной фракции. Однако очень часто количество вещества, которое удается при этом получить, слишком мало. В таких случах целесообразно прибегнуть к микро-ВЭЖХ, которая позволяет анализировать с высокой чувствительностью малые пробы.

0 5 Ю

Время, мин

Рис. 7-27. Определение обакунона после предварительного разделения пробы методом ТСХ. Колонка 0,5 мм (внутр. диам.) х 18 см; Fine SIL Cjg; подвижная фаза ацетонитрил/0,1 %-ная фосфорная кислота (50/50); объемная скорость 15 мкл/мин; детектор УФ, 210 нм; объем пробы 0,1 мкл.

Моришита и сотр. описали успешное определение обакунона и нарингина в плодах цитрусовых путем сочетания микро-ВЭЖХ и ТСХ [20]. Искомые соединения экстрагировали из обезжиренных семян летних апельсинов, экстракт подвергали предварительному разделению методом ТСХ с дихлорметаном в качестве подвижной фазы. Пятно, которое предположительно (устанавливалось сравнением с тонкослойной хроматограмой

Применение микромасштабной ВЭЯгу

стандарта) принадлежало обакунону, соскабливали с пластинки, экстрагировали порошок ацетоном и отгоняли последний. После этого пробу анализировали методом ВЭЖХ для окончательной идентификации обакунона. На рис. 7-27 изображена типичная хроматограмма, полученная описанным способом.

7.2.10. Применение флуоресцентного детектирования в микро-ВЭЖХ

Хиби и Канеучи сконструировали проточную микрокювету для флуоресцентного детектора с камерой объемом 0,6 мкл,