коомасштабной B3*q

р^именение микромасштабной ВЭЖХ 161

10 20

Концентрация, не/мл

гдособности, чувствительности и правильности выгодно отличается от методов ГХ, ГХ-МС, тонкослойной хроматографии (ТСХ) и ВЭЖХ с УФ-спектрометром или рефрактометром в качестве детекторов. В данном методе определяемые соединения после их разделения подвергаются воздействию определенных ферментов с тем, чтобы получить такие их производные, которые легче поддаются детектированию. 3-0кситруппы желчных кислот окисляются до к его-групп, а /Э-никотинамид-адениндинуклеотид (NAD) одновременно восстанавливается до NADH, и это последнее соединение детектируется флуоресцентным методом.

Применение миквомасштабной ВЭЖУ

На рис. 7-1 показаны блок-схемы систем микро-ВЭЖХ, предназначенных для определения желчных кислот. В системе а предусмотрены два насоса, один из которых служит для подачи реагента (NAD). В системе б подвижная фаза уже содержит NAD, поэтому дополнительный насос не требуется. Другим преимуществом второй системы является повышение чувствительности вследствие устранения пульсаций потока [б].

Чувствительность определения желчных кислот сильно зависит от рН подвижной фазы. Максимальная чувствительность достигается при рН 10 [7]. Однако для сохранения стабильности разделительной колонки и NAD рН подвижной фазы поддерживается на уровне 9.

На рис. 7-2 показана хроматограмма, полученная при разделении смеси желчных кислот на колонке с силикагелем, модифицированным ОДС. Подвижная фаза содержит NAD в концентрации 1,8 ммоль/л. Желчные кислоты (каждая в количестве примерно 20 нг) детектируются флуоресцентным детектором) с чувствительностью, превышающей обычную для ВЭЖХ примерно в 50 раз. Предел обнаружения (при отношении сигнал/шум - 2) составляет 0,13 - 0,28 пмоль.

Желчные кислоты присутствуют в сыворотке крови в очень малых концентрациях. При анализе разбавленных пробШ

ушменеиие микромасштабной ВЭЖХ

хорошие результаты дает метод предварительного концентрирования на микроколонке, который подробно описан в гл. 3. Желчные кислоты удовлетворительно концентрируются на предколонке с силикагелем, модифицированном ОДС. При дом сыворотку разбавляют в соотношении 1:10 фосфатным буфером (рН 7-8) [7]. Как следует из рис. 7-3, между концентрацией желчной кислоты и высотой пика наблюдается линейная зависимость.

На рис. 7-4 и 7-5 изображены хроматограммы, полученные при определении желчных кислот в пробах сыворотки крови объемом 0,1 мл, взятых у здорового человека и .у больного алкогольным циррозом печени 17]. Верхние хроматограммы получены с применением послеколоночной дериватизации; в этих опытах детектировались все флуоресцирующие соединения, отличные от NADH. Содержание желчных кислот, вычисLL

I I 1 1 1 L.'

о го ФО во so too

а

ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОМАСШТАБНОЙ ВЭЖУ

Применение микромасштабной ВЭЖХ

165

ленное исходя из нижних хроматограмм рис. 7-4 и 7-5, существенно различается.

На рис. 7-6 приведены хроматограммы желчных кислот, содержащихся в сыворотке крови теленка [8]. Помимо пиков желчных кислот на хроматограммах присутствует много пиков других соединений.

№0

w so so

Рис. 7-6. Определение желчных кислот в сыворотке крови теленка. Условна опыта те же, что и иа рис. 7-2, но объем пробы равен 0,1 мл. а - хроматогра-фироваиие без постколоики, 6 -с постколонкой. Обозначения те же, что и на рис. 7-2.

Рис. 7-7. Хроматогра-фическое разделение даисилпроизводных аминокислот с применением градиентного злюирования. Колонка 100 мм х 0,34 мм (внутр. диам.), неподвижная фаза ODS-Hypcrsil (3 мкм); подвижная фаза ацето-нитрил/ацетат аммония (0,13 моль/л), изменение концентрации подвижной фазы в ходе разделения показано на рисунке; объемная скорость 4,2 мкл/мии; детектор УФ, длина волны 222 нм..

Пики: / - Asp, 2 - Glu, 3 - Hyp, 4 -Asn, 5 - Ser, 6 - Thr, 7 - Gly, 8 - Ala, 9 -Pro, 10 - Val, 11 -Nval, 12 - Met, 13 -He, 14 - Leu, IS -Nleu, 16 - Trp, 17 -Phe, lg - NH2, 19 -di-Cya, 20 - Cys. Каждому пику соответствует около 40 пмоль вещества.

ШПрименение микромасштабной

7.2.3. Определение аминокислот в соевом соусе и в сакэ*

Анализ аминокислот методом жидкостной хроматографии разрабатывался многими исследователями. В настоящее время одним из самых чувствительных считается ВЭЖХ-метод определения аминокислот ? в виде дансилпроизводных. Получают указанные производные путем обработки пробы аминокислоты 5-диметиламинонафталинсульфанилхлоридом (дансилхлоридом или ДНО.

На рис. 7-7 изображена хроматограмма, полученная при градиентном элюировании смеси дансилпроизводных аминокислот; разделение проводилось на колонке, заполненной силика-гелем, модифицированным ОДС [9]. Предел обнаружения (при отношении сигнал/шум - 2) составлял около 0,1 пмоль.

На рис. 7-8 и 7-9 приведены полученные при градиентном1 элюировании хроматограммы аминокислот, содержащихся в соевом соусе и сакэ [9]. Чтобы перевести присутствующие в этих образцах аминокислоты в дансилпроизводные рН раствора пробы доводили до 9,7 и обрабатывали реаген