емени 2 с форма пика искажается на 5- 10%. В то *s время при увеличении постоянной времени с 0,2 до 2,0 с of

3 мин

5 мин

'ж. 4-12. Влияние постоянной времени детектора на форму пика и чувстви*"?н0<^паналим- Посто,,ниая времени 0.2 с (а и а) и 2 с (в, г). Колонки а

« о - 250 мм х 1,5 мм (внутр. диам.), неподвижная фаза Fine SIL Ci« (10

"км)- в и г - 4,6 мм (внутр. диам.) х 50 мм, иеподвижаня фаза Fine SDL

48 (3 мкм). Пробы, при разделении которых получены хроматограммы а и

"•те же. что и на рис. 4-10 и 4-11; хроматограммы виг получены при

Разделении пробы, содержащей ОГ-токоферол (У), б-токоферол (2), Y-токоферол (3) и' й-токоферол (4). '

ношение сигнал/шум увеличивается более чем втрое. Сравнение хроматограмм виг позволяет выявить другую закономер-Г°сть- Обе эти хроматограммы получены на колонках размером 50 мм х 4,6 мм (внутр. диам.), объем которых составляет коло 20% объема обычных колонок. Соответственно меньше

впеПР°ДОЛЖИтельность анализа- Хроматограмма в (постоянная Ремени 0,2 с) отличается удовлетворительной формой пиков и орогдим разделением. Это справедливо даже для пиков с вре-ВДем удерживания меньше 2 мин. На хроматограмме г {ао-^янная времени 2 с) пики с временем удерживания менее

4. Детектирующие системы

2 мин заметно размыты. Однако для пика с временем удерживания порядка 2,5 мин размывание уже почти незаметно; в то же время отношение сигнал/шум для всех пиков заметно лучше. Таким образом, при выборе постоянной времени необходимо стремиться получить максимальную чувствительность при незначительном размывании пика определяемого соединения.

4.4. ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ ДЕТЕКТОРЫ ||

Как уже указывалось выше, основные преимущества микро- и полумикроколонок это небольшой расход растворителя и более высокая чувствительность, обусловленная снижением объемной скорости подвижной фазы. Сочетание таких колонок с вольтамперометрическими детекторами имеет следующее преимущество: при малой объемной скорости повышается эффективность работы электродов, и даже при уменьшении объема ячейки детектора ожидать уменьшения чувствительности не приходится.

Ниже рассмотрены миниатюризованные вольтамперометри-ческие детекторы, пригодные для полумикро- и микро-ВЭЖХ.

4.4.1. Миниатюрные одноэлектродные Ц

вольтамперометрические детекторы *»*

Миниатюрные вольтамперометрические детекторы с одним рабочим электродом можно подразделить на два типа: с пленочной [16, 17] и с трубчатой ячейкой [18, 19]. В детекторе первого типа, описанном Гото и сотр. [16], камера ячейки изготовлена из двух фторопластовых блоков, разделенных фторопластовой же пленкой толщиной 2-45 мкм и шириной 0,5- 2 мм. Рабочий электрод, изготовленный из стеклоуглерод-ных дисков диаметром 3 мм, встроен в один из блоков. Хло-ридсеребряный электрод сравнения установлен в цилиндриче-| ском отверстии во втором блоке. Трубка из нержавеющей ста ли служит одновременно противоэлектродом и выходной яяЛ нией. Объем ячеек такого типа составляет от 0,06 до 0,3 мкл-|

Описанная ячейка использовалась для детектирования из меров аминофенола после их разделения на микроколонке мером 147 мм х 0,5 мм (внутр. диам.), заполненной силикаге-лем, модифицированным ОДС, при объемной скорости 8,3 мкл/мин. Пределы обнаружения исследуемых изомеров составляли около 10 пг, линейный динамический диапазон достигал 103. В другом случае та же ячейка применялась для детектирования желчных кислот после их разделения на микрокодов'

4. Детектируюише системы

Ш

кс при такой же объемной скорости. По выходе из колонки определяемые компоненты обрабатывались За-гидроксистероид-ной дегидрогеназой (За-HSD) с целью получения необходимых производных [20]. Микроколонка, на которой осуществлялось это разделение, представляла собой фторопластовую трубку размером 114 х 0,5 мм (внутр. диам), заполненную силикаге-лем (5 мкм), модифицированным ОДС. Реакционная колонка, установленная за разделительной колонкой, представляла собой трубку из фторопласта размером 20 мм х 0,5 мм (внутр. диам.), заполненную стеклянными шариками (200 - 400 меш) с контролируемой поверхностной пористостью, модифицированных иммобилизованной HSO. За-Гидроксильные группы молекулы желчной кислоты окислялись в присутствии фермента до ке-тогруппы; в то же время /3-никотинамидадениндинуклеотид (NAD) переходил в восстановленную форму (NADH), которая и детектировалась вольтамперометрически.40г60

0,6 0,3 о

?, В (относительно kg (ЛдСЦ

На рис. 4-13 изображены циклические полупроизводные и полуинтегральные вольтамперограммы NAOH, полученные Ъ фосфатном буфере (рН 7,0) при скорости развертки 100 мВ/с со стеклоуглеродным рабочим электродом. Из рисунка видно,

4. Детектирующие системы

что NADH электрохимически активен и необратимо окисляется в данной среде с образованием NAD. Для высокочувствительного детектирования NADH потенциал рабочего электрода детектора следует установить равным значению, соответствующему концу волны окисления в полупроизводной циклической вольтамперограмме.

На рис. 4-14 изображены