химический каталог




Количественный анализ стероидов

Автор Ш.Гёрёг

на колонке, заполненной силикагелем.

При подготовке проб для определения стероидных гормонов в биологических объектах по меньшей мере такую же важную роль, как и колоночная хроматография, играет тонкослойная хроматография. Ее часто используют для удаления примесей из пробы и фракционирования на индивидуальные соединения или зоны, пригодные для последующего анализа. Эта стадия часто сочетается с разделением на хроматографической колонке, как это показано на следующем примере, включающем три стадии хроматографирования в тонком слое: две — для очистки свободных стероидов и третья — для очистки их моно170 Глава 2

Половые гормоны и родственные соединения 171

хлорацетатов. Микан [552] описал газохроматографический метод определения насыщенных метаболитов прогестерона в мышечной оболочке матки человека. После экстракции и разделения на «свободную» и «сульфатную» фракции путем другой, жидкость-жидкостной, экстракции сульфатную фракцию очищают на колонке, заполненной LH-20 [хлороформ—метанол (1:1) с добавкой 0,1 ммоля хлорида натрия]. После отщепления сульфогрупп полученные свободные стероиды хроматогра-фируют на пластинке, покрытой силикагелем, используя смесь хлороформ—ацетон (9:1) для отделения монооксипрегнановой фракции (RF 0,52—0,57). При дальнейшем хроматографирования этой фракции [гексан—этилацетат (3:1)] с тремя обнаруживающими агентами происходит разделение эпимеров З-оксипрегнан-20-она. Окончательную очистку фракций перед анализом проводят после перевода в монохлорацетаты.

В приведенном выше примере, и вообще в большинстве случаев, когда анализу предшествуют стадии экстракции и хроматографирования, необходимо контролировать полноту разделения на этих стадиях, используя меченые стероиды в качестве радиоактивных индикаторов.

Расщепление конъюгатов

Если целью анализа не является определение индивидуальных конъюгатов (и при этом имеется достаточно избирательный метод, обычно ВЭЖХ), конъюгаты следует перевести в свободные стероиды отщеплением сульфогруппы или глюкуронид-ной группировки. Это обязательный этап анализа стероидов, содержащихся в моче, но его часто включают и в схемы анализа проб сыворотки или плазмы крови.

В зависимости от поставленной задачи расщепление можно проводить непосредственно в разбавленной пробе или после экстракции растворителем. Очень часто после разделения на колонке или в тонком слое конъюгаты подвергают гидролизу. В этих случаях можно получить количественные результаты для индивидуальных конъюгатов, или по крайней мере для их фракций, не прибегая к селективным методам определения.

В настоящее время из различных способов расщепления конъюгатов стероидов чаще всего используют ферментативный гидролиз. Ферментами в этих реакциях служат арилсульфатаза для расщепления 3-сульфатов эстрогенов, стероидная сульфа-таза для 3-сульфатов других стероидов и р-глюкуронидаза для глюкуронидов различных стероидов. Наиболее подходящим источником всех трех ферментов является сок улитки Helix ро-matia. Полученные из нее очищенные экстракты чаще всего используют при анализе стероидов в моче [6, 21, 54, 486].

Обычно гидролиз проводят при рН 4,5—5,0 (ацетатный буфер), температуре около 37°С и времени реакции 12—48 ч. Другой широко используемой комбинацией ферментов для гидролиза стероидов, содержащихся в моче [213, 629, 685, 856] и плазме [596, 691], служит глюсулаза (смесь арилсульфатазы и Р-глю-куронидазы) при аналогичных условиях. Если сульфаты отсутствуют, отделены или селективно разложены, часто используют одну р-глюкуронидазу [68, 90, 488, 542].

Основной причиной вытеснения классических методов расщепления (включающих использование концентрированных минеральных кислот при повышенной температуре) ферментативными методами является разложение в жестких условиях многих стероидов. Сейчас классические методы используют только для расщепления конъюгатов эстрогенов, которые достаточно устойчивы, чтобы сохранить свою структуру при такой обработке [767, 848] *. Например, Милнер и Табер [557] в начале определения эстриола в моче беременных разбавляют 1—2 мл пробы до 6 мл водой, добавляют 0,9 мл концентрированной соляной кислоты и нагревают раствор в автоклаве в течение 15 мин при 0,105 МПа. Вейс [829] показал, что даже в этих случаях правильность анализа можно улучшить, если разбавить пробу мочи водой (1 :50) и очистить ее на сефадексе или осадить конъюгаты добавлением сульфата аммония с тем, чтобы понизить концентрацию компонентов мочи, мешающих определению в сильнокислой среде. Хроматографическая очистка пробы полезна также при ферментативном анализе, так как при этом можно удалить ферменты-ингибиторы [315, 615].

Следует заметить, что в некоторых случаях для полного гидролиза требуются гораздо более мягкие условия. Например, сульфат дегидроэпиандростерона полностью гидролизуется при кипячении в течение 4 ч в ацетатном буферном водном растворе (рН 4,5) [548]. Более распространенным приемом расщепления сульфатов является сольволиз в этилацетатных растворах [43, 68, 488, 713 и т. д.

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189

Скачать книгу "Количественный анализ стероидов" (6.71Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
обучение монтажник систем вентиляции
экономичная печь долгого горения литовская для жилого дома
можно ли ртправить героскутер самолетом из евросоюза
аксессуары для ванной комнаты опт

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)