химический каталог




Количественный анализ стероидов

Автор Ш.Гёрёг

является одной из разновидностей метода конкурирующего связывания белка и тесно связан с радиоиммунным анализом. Он рассматривается здесь, а не в разд. 2.2.13, потому что в нем не используются радиоизотопы (в этом его главное достоинство), а определение основано на ферментативной реакции.

Основное отличие этого метода от РИА состоит в том, что для выработки антисыворотки получают комплекс стероид— белок, связанный ковалентной связью, и конкуренция за активные центры антител происходит между комплексом . белок— определяемый стероид и комплексом фермент—стероид; в результате при изменении концентрации стероида меняется активность фермента, что можно количественно измерить при помощи какой-либо подходящей ферментативной реакции.

Применению этого метода в аналитической химии стероидов посвящено множество публикаций, например для определения эстрадиола [4, 599], эстриола [472, 561, 609], общего содержания эстрогенов [93, 338а], тестостерона [93, 3836, 651—653, 761, 857] и прогестерона [425—427] в плазме и сыворотке. Чаще всего рекомендуется пероксидаза хрена [93, 425—427, 599, 651, 652, 653, 857], но описано также применение p-D-ra-лактозидазы [4, 3836], глюкоамилазы [761] и щелочной фосфа-тазы [561]. Для связывания стероидов с ферментами используются те же реакции, что и для образования комплексов белок—стероид в радиоиммунном анализе, т. е. сочетание посредством О-карбоксиметоксима 6-кетопроизводных эстрогенов и такого же производного Д4-3-кетостероидов по С-3, или соединение через гемисукцинат (в качестве мостика) с 11а-оксипро-изводным последних стероидов. Конъюгаты обычно очищают диализом и хроматографированием на сефадексе Q-25.

Эти комплексы служат иммуногенами при выработке антисыворотки в организме животных. Большинство методов, используемых в анализе стероидных гормонов, связано с образованием гетерогенных систем *, т. е. ферментативную активность определяют после отделения комплекса стероид—фермент (остающегося в растворе) от комплекса стероид—фермент—антитело. В большинстве случаев антитела иммобилизуют, связывая их ковалентной связью с CNBr-активированной сефарозой [4, 425—427, 857], целлюлозой [425—427, 651, 652, 663] или частичками я-акриламинового стекла [599], которые затем отделяют центрифугированием и измеряют активность фермента в надосадочной жидкости или осадке. Джойс и сотр. [427] установили, что гораздо большей чувствительности можно добиться, используя микрокристаллическую целлюлозу, а не сефарозу. Еще одним приемом иммобилизации является связывание антител стенками полистирольной пробирки [93]. Возможны и другие варианты, основанные на отделении комплекса антиген—антитело методом двойных антител [561, 761] или на использовании полиэти-ленгликоля [609].

В методе конкурирующего связывания белка можно использовать тот же комплекс фермент—стероид, что и при выработке антисыворотки (гомологичные системы), или другой комплекс (гетерологичные системы). Преимущество первых — более высокая избирательность, тогда как вторые обеспечивают лучшую чувствительность [93].

После разделения фаз измеряют активность фермента, которая пропорциональна концентрации стероида; при этом

150 Глава 2

Половые гормоны и родственные соединения 151

широкое применение нашли спектрофотометрические и флуори-метрические методы. В методах с использованием пероксидазы различные органические восстановители подвергают ферментативному окислению пероксидом водорода с образованием хромофоров или флуорофоров, концентрация которых пропорциональна концентрации фермента (катализатора). Такими системами являются 5-аминосалициловая кислота и пероксид водорода (спектрофотометрирование при 490 нм) [651—653], о-фенилендиамин и пероксид водорода (492 нм) [93, 425—427] и 4-окси-З-метоксифенилуксусная кислота и пероксид водорода (флуориметрический контроль при 420 нм, возбуждение при 390 нм) [599]. При использовании B-D-галактозидазы измеряют поглощение о-нитрофенола, образующегося при ферментативной реакции из о-нитрофенил-р-Б-галактозида, при 405 нм в щелочной среде [4, 3836]. Реакции с использованием глюко-амилазы можно контролировать флуориметрически по глюкозе, образующейся из амилозы А [761]. На поглощении при 500 нм хинониминового красителя, образующегося из 4-аминоантипи-рина, пероксида водорода и фенола в присутствии пероксидазы (фенол получается из фенилфосфата при действии щелочной фосфатазы), основаны методы определения последней [561].

В качестве примера широко используемых гетерогенных методов на рис. 2.21 приведена схема методов определения прогестерона в плазме, разработанного Джойсом и сотр. [426].

Кроме рассмотренных до сих пор гетерогенных систем Йорде и сотр. [857] предложили системы другого типа с использованием комплекса антитело—фермент и иммобилизованного антигена. Тестостерон 3-о-карбоксиметоксим связывается с CNBr-активированной сефарозой через желатиновый мостик. Связывание антитела с этим иммобилизованным антигеном конкурентно ингибируется определяемым тестостероном. Комплекс

страница 49
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189

Скачать книгу "Количественный анализ стероидов" (6.71Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
armonia marfil плитка
AMS W7207-1
Стол Kubik Портофино-2 Рис-0 ноги хром
Двухтопливные котлы Unical ELLPREX 630

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)