химический каталог




Количественный анализ стероидов

Автор Ш.Гёрёг

со скоростью 0,5 мл/мин.

В большинстве случаев при определении конъюгатов желчных кислот в биологических жидкостях методом ВЭЖХ применяют колонки с химически связанными неподвижными фазами, например с различными обращенными фазами Ci8 [26, 35а, 73а—в, 76а, 90а, 123а, 127а, 134а, 135] и «колонки с жирными

(6.1>

410 Глава 6

Желчные кислоты 411

Фотометрический вариант метода [15, 31, 48, 58, 79, 93, 163, 189, 196] характеризуется средней чувствительностью (молярный коэффициент поглощения НАДН при 340 нм равен 6300 [24]). Поскольку НАДН флуориметрически активен (длина волны возбуждения 345 нм, испускания 450 нм), чувствительность значительно увеличивается при использовании флуоримет-рического варианта метода [15, 20, 61, 80, 116, 132, 144, 168, 195].

Из ферментов используют За-оксистероид—дегидрогеназу (За-ОСДГ) и 7а-оксистероид—дегидрогеназу (7а-ОСДГ). При использовании недостаточно чистых ферментов селективность методики снижается. Например, Энгарт и Тернер [58] отмечали влияние спиртов (образование НАДН), являющихся растворителями желчных кислот. Эти помехи можно легко устранить при удалении спирта из реакционной смеси. Доступные в настоящее время высокочистые ферменты способствуют решению проблемы селективности. Определению желчных кислот в образцах сыворотки могут мешать ферменты, содержащиеся в сыворотке, поэтому перед добавлением реагента их инактивируют, например нагреванием при рН 9 и 67°С в течение 20—30 мин [124, 142].

Что касается селективности внутри класса желчных кислот, то необходимо сказать, что За-ОСДГ-НАД окисляет все главные желчные кислоты, и поэтому его можно применять для определения общей концентрации желчных кислот. Чувствительность реакции относительно глициновых и тауриновых конъюгатов та же [58]. Если цель анализа состоит в получении данных о концентрациях индивидуальных желчных кислот и их конъюгатов, то их следует предварительно разделить методом ТСХ или электрофореза на ацетатцеллюлозном геле [20, 80, 116]. Элюаты, полученные вымыванием зон хроматограмм, исследуют с помощью ферментативного метода. Конъюгаты пары дезоксихолевая кислота — хенодезоксихолевая кислота с помощью ТСХ разделить трудно. Для устранения этих трудностей Макдональд и др. [114, 116] поступали следующим образом: определяли флуориметрическим методом суммарное содержание конъюгатов дезокси- и хенодезоксихолевой кислот, как описано выше, а с помощью 7а-ОСДГ [см. схему (6.2)] селективно определяли конъюгаты хенодезоксихолевой кислоты. Современный вариант этого метода [116а] включает три стадии с использованием За-ОСДГ, 7а-ОСДГ и 12а-ОСДГ.

При ферментативном определении 3-кетопроизводных желчных кислот обычно их предварительно восстанавливают борогидридом натрия [14—16]; описано также и ферментативное восстановление кетогруппы со спектрофотометрическим контролем расхода НАДН [3].

НАДН

(6.2)

Следует заметить, что равновесие реакции [схема (6.2)] смещается вправо, если связывать образующиеся кетопроизвод-ные в форме производных гидразина. Для этого обычно применяют гидразингидрат [20, 31, 48, 58, 61, 93, 163, 189], но описано также применение семикарбазида [163] и реактива Т Жирара [163]. Реакции обычно проводят в слабощелочной среде при инкубировании в течение 30—40 мин. Для введения поправки на фоновое поглощение или флуоресценцию применяют подходящий реагент и проводят холостой опыт.

+ НАДН

ноВ наиболее современном варианте ферментативного определения желчных кислот дальнейшее увеличение селективности достигается за счет проведения дополнительной ферментативной реакции. Осуга и др [142], Скред и др. [174], Бруусгаард и др. [30] и Гилус-Мо и Гогстад [68] использовали метод, предложенный Машиге и др. [124], для серийного определения желчных кислот сыворотки. В этом методе НАДН, образующийся в первичной реакции, взаимодействует с резазурином в присутствии диафоразы с образованием флуориметрически активного продукта — резоруфина (длина волны возбуждения 565 нм, испускания 580 нм).

+ НАДН

с;

н

О (6-3)

НАДН 4-НО'

рвзазурин

резоруфин

412 Глава 6

Желчные кислоты 413

Согласно методике [142], 0,1 мл сыворотки смешивали с 2,5 мл буферного раствора (рН 9) и нагревали для инактивации ферментов при 67°С в течение 20 мин. Затем прибавляли 0,4 мл реагента, содержащего 0,1 мл За-ОСДГ (0,0048 ME), 0,1 мл 0,5 мкМ НАД, 0,1 мл диафоразы (0,25 ME) и 0,1 мл 200 мкМ резазурина. Смесь инкубировали 40 мин при 20°С. Для введения необходимых поправок проводили холостой опыт, используя воду вместо сыворотки или то же самое количество сыворотки, но в отсутствие За-ОСДГ. Линейный градуировоч-ный график можно построить для интервала концентрации желчной кислоты от 0 до 80 мкмоль/л. Увеличение селективности метода позволяет опустить стадию экстракции при определении желчных кислот в сыворотках и делает его пригодным даже для анализа окрашенных фекальных экстрактов [18].

Обзор работ по применению ферментов для определения желчных кислот не будет полным, если хотя бы кратко не упомянуть о ф

страница 151
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189

Скачать книгу "Количественный анализ стероидов" (6.71Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ar 400e4-k
G9F08AA
мебельные ручки linea cali с кристаллами swarovski
персональный кинозал под ключ

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(19.10.2017)