химический каталог




Количественный анализ стероидов

Автор Ш.Гёрёг

Например, было найдено, что в процессе метаболизма витамина D3 происходит потеря трития в положении 1, что свидетельствует о превращении 1-оксипроизводного в 1-кетопроиз-водное [60]. Путем изучения методом ВЭЖХ меченных тритием метаболитов витамина D3 и синтетических меченных тритием гидроксилированных производных витамина D решен.а проблема конфигурации при С-25 у 25,26- (ОН)2-D3, образующегося в организме человека [169а].

Наиболее важным и характерным радиоаналитическим методом, применяемым для определения витаминов D, главным образом их гидроксилированных производных в крови, яв* ляется метод конкурирующего связывания белка. Чувствительность этого метода выше чувствительности ранее обсуждавшихся хроматографических методов, поэтому он пригоден для определения метаболитов в количестве нескольких нанограммов в 1 мл, а в некоторых случаях и более низкого их содержания. Высокая чувствительность, а также необходимость знать точное содержание этих соединений в крови привели к тому, что за последние 10 лет по этому вопросу опубликовано чрезвычайно большое количество статей. Объем настоящей книги не позволяет провести детальное обсуждение всех статей (в большинстве случаев близких по содержанию), поэтому в свете последних данных рассмотрим в общих чертах наиболее общепринятые методики. Они обычно включают следующие стадии:

а) Экстракция. К нескольким миллилитрам образца сыворотки или плазмы крови добавляют небольшое количество

меченного тритием определяемого метаболита (обычно в этаноле). Полученный таким образом раствор либо экстрагируют

дихлорметаном [55, 56, 119], или смесью хлороформ—метанол

[73, 156], или смесью дихлорметан—метанол [23, 82], либо разбавляют этанолом и центрифугируют [34, 48, 58, 63, 89, 101,

132, 150].

б) Хроматография. Почти во всех методиках экстракты

подвергают хроматографированию на колонке. Одна из целей

этой стадии заключается в удалении сопутствующих липидов

перед добавлением связывающего белка. С другой стороны,

специфичность этих белков не достаточно высока, чтобы можно

было с нужной селективностью определять отдельные метаболиты. Отделение перед радиоизотопным анализом родственных

соединений с помощью колоночной хроматографии позволяет

решить эту проблему и сильно повысить воспроизводимость результатов.

В ранних исследованиях обычно применяли колонки с кремнекислотой (см. табл. 5.3), но сейчас это бывает значительно реже [За, 58, 123а, 124, 132, 168]. В настоящее время чаще используют колонки с сефадексом LH-20 [23, 48, 49, 55, 56, 73, «4, 89, 92, 1016, 119, 156, 178а, 179, 200, 201]. Соответствующие фракции, полученные путем хроматографирования, после добавления связывающих белков пригодны для анализа. Фрак-связывания белка обсуждается в разд. 5.2.9. ционирование с помощью ВЭЖХ перед применением метода

Следует отметить, что, хотя обычно используют хроматографическую очистку, в случае определения только главного метаболита (25-ОН-витамин D) описано несколько примеров успешного проведения анализа без стадий хроматографирования [34, 63, 101, 150].

24 Заказ М 182

370 Глава 5

Витамины D и родственные соединения 371

в) Метод конкурирующего связывания. После хроматогра-фической очистки анализируемую фракцию обычно упаривают, растворяют в этаноле (около 0,05 мл) и смешивают с приблизительно таким же объемом этанола, содержащего меченный тритием метаболит. К смеси добавляют связывающий белок (около 1 мл) в виде суспензии в фосфатном или диэтилбарби-туратном буфере. Смесь (содержащую в особых случаях также и добавки) инкубируют при комнатной или более низкой температуре примерно 1—2 ч. За это время устанавливается равновесие в местах специфического связывания белка между немеченой и меченной тритием формами анализируемого метаболита. Немеченый метаболит присутствует в более высокой концентрации, меченный тритием метаболит, образующий комплекс с белком,— в более низкой. Концентрацию последнего измеряют с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика после удаления свободных стероидов центрифугированием в присутствии пропитанного декстраном древесного угля, добавляемого после инкубирования.

Концентрацию рассчитывают по градуировочному графику, построенному аналогичным образом с известными количествами определяемого метаболита. При вычислениях следует учитывать количество меченного тритием соединения, добавленного перед экстракцией (для проверки правильности результатов), и неспецифическое связывание (определяют отдельно). На рис. 5.8 показана типичная калибровочная кривая, взятая из статьи Тейлора и др. [201].

Специфичность измерений сильно зависит от эффективности предварительного хроматографического разделения и специфичности связывающего белка. Наиболее часто применяемые связывающие белки получают из сыворотки рахитичных цыплят или крыс [48, 49, 92, 121а, 123а, 155, 156, 168], сыворотки человека [За, 58, 179], плазмы крови больных остеомаляцией [101], почек рахитичных цыплят или крыс [84, 119, 124, 132, 150, 178а, 200, 201] или слизист

страница 135
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189

Скачать книгу "Количественный анализ стероидов" (6.71Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
адвокат трудовое право
замена гофр volvo
купить импортный журнальный столик
Фирма Ренессанс: лестницы на второй этаж модульные лестницы- быстро, качественно, недорого!

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)