химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

е маркеров удобно использовать окрашенные высокомолекулярные вещества (например, меченные флуоресцеином ферритин или ^-глобулин), которые не задерживаются частицами геля. Гель-фильтрацию проводят до» тех пор, пока маркер не пройдет по крайней мере 10 см от линии старта. После этого пластинку извлекают из рамки и покрывают слой носителя листом фильтровальной бумаги (например, Шляй-хер-Шуль 2043 или ватман 3 ММ), вырезанным по размеру пластинки. Некоторые исследователи рекомендуют применять в этом случае лист сухой фильтровальной бумаги. В нашей лаборатории используется смоченная и тщательно отжатая фильтровальная бумага, так как с ее помощью легче прикрыть слой носителя без образования под бумагой пузырьков воздуха. После этого бумагу снимают (иногда вместе с частичками геля), высушивают при температуре около 120°С и окрашивают красителями, выявляющими белок, или реактивом Паули. Наряду с другими красителями можно воспользоваться, например, амидовым черным 10В, кислым фуксином и т. п. Во время отмывания несвязавшегося красителя частички геля отделяются от бумаги, и после высушивания она может быть использована для документации.

В нашей лаборатории гель-фильтрация в тонком слое сефадекса G-150 используется для анализа фрагментов молекул иммуноглобулинов, полученных при ферментативном гидролизе. 5,0 г се? ?-^'?^^^^Д!-- 4— -4т: ^4"- "К^. - 4~;3

iHBlii

Фиг, 47. Гель-фил ьтрация ферментативно расщепленного IgG человека в том-ком слое сефадекса G-150.

Пятна слева', папаииорый гидроявзат, полученный без предварительного окисления SH-rpjnm (вверху иерасщеплсниый белок, вивау — смесь фрагментов Fab ж Fc); пятно лосередиие — г(вЬ')1-фрагкеиты, полученные при гидролизе пепсином; пятно справа — смесь фрагмектов Fab я Fc, полученных при гидролизе лапанном.

фадекса G-150 оставляют для набухания в 150 мл буферного раствора (0,075 М фосфатный буферный раствор рН 7,0, содержащий 0,075 М NaCl). Через 5—6 ч гель-фильтрации гидролизат делится на фракцию нер зацепленного IgG, фракцию двухвалентных фрагментов (5S) и фракцию одновалентных фрагментов (3,5S), четко различимых на хроматограмме (фиг. 47).

Комбинированное использование тонкослойной гель-фильтрации с электрофорезом или иммунодиффузией до настоящего времени представляет собой один из наиболее тонких методов микроанализа белков. Хансон и др. [10] разработали метод двумерного разделения, используемый для анализа белков. На первом этапе белки подвергают гель-фильтрации в тонком слое сефадекса G-200 или G-100, а на втором —• электрофорезу. Они предложили прибор, в котором хроматографическую пластинку можно закреплять под углом для гель-фильтрации и горизонтально для электрофореза. В описанных экспериментах использовали стеклянные пластинки размером 30x30 см и толщиной 1 мм, на которые наносили слой геля сефадекса толщиной 0,5 мм. Для набухания сефадекс оставляли в 0,03 М ве-роналовом буферном растворе рН 8,6. Сначала проводили гель-фильтрацию, а затем в направлении, перпендикулярном первому, в течение 3 ч вели электрофорез при градиенте напряжения 10 В/см. Этот метод весьма успешно был применен для анализа сывороток крови человека, спинномозговой жидкости н гормона роста.

Грант и Эвералл 18J м Хансов и др. [101 предложили методику иммуно-гель-фильтрации. После проведения гель-фильтрации сефадекс, расположенный по обе стороны от области разделения исИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ В ФИКСИРОВАННОМ СЛОЕ ИОНООБМЕННИКА1

Ионообменная тонкослойная хроматография в фиксированном слое ионообменной смолы — новый метод в биохимии. Бесспорно, в настоящее время среди известных способов фракционирования ионообменная хроматография является лучшим. В течение двух последних десятилетий это было подтверждено многочисленными экспериментами.

Ионообменная хроматография дала возможность автоматизировать анализ аминокислот, что открыло новую эпоху в биохимии белка и ряде других областей молекулярной биологии. Однако при применении классической ионообменной хроматографии на колонках чрезвычайно большую роль играет фактор времени. Основные проблемы в методах хроматографии на колонке возникают при оценке фракционирования и проведении параллельных экспериментов.

Из характера метода следует, что для оценки требуется сложная по конструкции и дорогая полуавтоматическая или автоматическая аппаратура. Если же ее нет, неавтоматическое фракционирование, при котором каждую фракцию из коллектора нужно отдельно проанализировать, требует больших затрат времени.

Производительность автоматического аминокислотного анализатора определяется числом анализируемых проб за данный промежуток времени; совершенно очевидно, что она значительно превышает производительность неавтоматического фракционирования.

1 Данная глава прислана Т. Дэвени специально для русского издания. Прим. ред.

Ясно, что для проведения параллельных опытов нужно иметь либо несколько автоматических установок, что с финансовой точки зрения допустимо лишь для небольшого числа лабораторий, либо большой штат.научных сотрудников

страница 99
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
проекторы кристи 20000 аренда
Рекомендуем компанию Ренесанс - лестница для бассейна купить - продажа, доставка, монтаж.
кресло престиж размеры
Интернет-магазин КНС Нева предлагает куплю планшет - от товаров до интеграции в Санкт-Петербурге!

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)