химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

G-200, особенно если фракционированию подвергаются белки, желательно оставлять в колонке над сефадексом немного буферного раствора, а исследуемый материал наносить под него. Это осуществимо, если плотность наносимого препарата больше плотности буферного раствора. Плотность фракционируемого белкового раствора можно увеличить, добавляя к нему соответствующее количество сахарозы.

3. Обычно гель-фильтрацию продолжают до тех пор, пока не элюируются все белки из колонки, поэтому после опыта колонку можно не отмывать. Однако все же рекомендуется перед каждым фракционированием пропустить через колонку несколько объемов буферного раствора.

4. Если колонку предполагается использовать в течение длительного времени, желательно суспендировать сефадекс в буферном растворе, содержащем мертиолат, фенол или толуол, для предотвращения бактериального роста. Сефадексы можно стерилизовать в автоклаве (при 110° С в течение 40 мин) без нарушения их свойств.

5. После того как гель сефадекса набух и отстоялся, следует тщательно удалить мелкие частицы, плавающие в надосадочной жидкости, так как они могут уменьшать скорость протекания элюента через колонку. ^

6. Элюирование можно также проводить раствором 0,1 М трис-НС1 рН 8,0, содержащим 1 М NaCl.

Г. РАЗДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ФРАГМЕНТОВ ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЕЙ НА КОЛОНКЕ С СЕФАДЕКСОМ

При анализе структуры белков очень часто приходится сталкиваться с изучением фрагментов, полученных при ферментативном гидролизе. Препаративное разделение таких фрагментов — один из этапов исследования белков. Весьма подходящим способом разделения фрагментов ферментативно расщепленных белков можно считать гель-фильтрацию на колонке сефадекса соответствующей марки. Очень хороший пример, демонстрирующий использование указанного метода, — разделение фракций IgG, гидролизованного папаином в присутствии или в отсутствие восстановителей. Если папаиновый гидролиз протекает в отсутствие восстановителей, то часть молекул IgG остается нерасщепленной, тогда как остальные молекулы расщепляются с образованием двух крупных хорошо изученных фрагментов (Fab и Fc) и мелких низкомолекулярных, частично способных проходить через мембрану при диализе пептидов. Молекулярный вес нативного IgG — 150 ООО, фрагментов Fab и Fc — около 50 ООО, мелкие пептиды имеют молекулярный вес 5 ООО и ниже. Гель-фильтрация на колонке с сефадексом G-100 позволяет довольно легко разделить эти три фракции папаинового гидролизата IgG.

1. Обработка сефадесса G-J00. Соответствующее количество сухого сефадекса G-100 суспендируют в дистиллированной воде и после отстаивания мелкие плавающие в надосадочной жидкости частицы декантируют. Процедуру удаления мелких частиц повторяют несколько раз до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет совершенно прозрачной. После этого сефадекс оставляют на сутки для набухания в дистиллированной воде. Набухший гель сефадекса уравновешивают 0,075 М фосфатным буферным раствором рН 7,0, содержащим 0,075 М NaCl, и загружают в колонку.

2. Гель-фильтрация. Для фракционирования папаинового гидролизата примерно 100 мг IgG используют колонку размером 2х ХбО см. После нанесения препарата его остатки смывают тремя порциями буферного раствора по 4 мл и начинают гель-фильтрацию со скоростью 40—60 мл/час. На кривой оптической плотности элюата появляются два следующие непосредственно друг за другом пика, а через некоторое время после них — третий пик. Фракция элюата, соответствующая первому пику, содержит негидролизованный IgG (резистентные к папаину молекулы IgG). Во фракции, соответствующей второму пику, содержатся Fab- и Fc-фрагменты. Третья фракция, соответствующая на диаграмме третьему пику, состоит из низкомолекулярных пептидов. После пропускания через колонку одного объема буферного раствора ее можно использовать вновь.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Выбор хроматографической колонки. Используемые для хроматографии колонки должны иметь определенную конструкцию. Независимо от типа колонки «холостое» пространство у ее дна должно быть минимальным. Если объем «холостого» пространства довольно большой, может происходить смешивание уже разделенных фракций, что будет снижать эффективность фракционирования. Необходимо следить за тем, чтобы частицы геля не забивали поры в расположенной на дне колонки поддерживающей пористой пластинке из стекла или металла. Для этого на пористую пластинку кладут кружок фильтровальной бумаги соответствующего размера. Очень удобны в работе колонки, изготовляемые фирмой Pharmacia Ltd. (Швеция); они практически лишены «холостого» пространства и позволяют вести хроматографию в обоих направлениях.

2. Длина колонки, объем наносимого препарата. Вообще для группового разделения удобны короткие (20—30 см), а для фракционирования — более длинные (до 100 см) хроматографические колонки. При аналитической гель-хроматографии объем наносимого препарата должен быть небольшим, но все же не менее 0,02 объема геля. При препаративной гель-хроматографии стараются наносить тот максимальный объем образца, при котором еще

страница 92
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
хранение шин в боксе
курсы бухучет в строительстве 1с в москве
пьяные шашки
Самое выгодное предложение от магазина компьютерной техники КНС Нева - MSI AP1622ET - в кредит не выходя из дома в Санкт-Петербруге, Пскове, Мурманске и других городах северо-запада России!

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)