химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

паративного фракционирования рекомендуется использовать сферические ионообменники. Ими легче заполнять колонку, они быстро оседают при отмывании декантацией и обеспечивают постоянную скорость протекания раствора через колонку в отличие от волокнистых и гранулярных носителей, которые вызывают снижение скорости протекания й процессе хроматографии.

2. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА КОЛОНКЕ С Ф0СФ0ЦЕЛЛЮЛ030Й

А. Подготовка колонки. Соответствующее количество фосфо-целлюлозы (Ф-целлюлозы) сначала с помощью декантации трижды отмывают дистиллированной водой, а затем последовательно: 0,5 М NaOH, дистиллированной водой, 0,1 М Н3Р04, дистиллированной водой и стартовым буферным раствором. Отмывание дистиллированной водой всегда продолжают до тех пор, пока рН надосадочной жидкости не достигнет рН воды. Окончательное уравновешивание лонообменника стартовым буферным раствором производят уже в колонке.

Б. Хроматография. На колонку размером 1x50 см пипеткой осторожно наносят 2 мл сыворотки, диализованной в течение суток против стартового буферного раствора. После того как нанесенная сыворотка войдет в Ф-целлюлозу, ее остатки смывают тремя порциями буферного раствора по 2 мл. Фракционирование белков производят с помощью ступенчатого элюирования, подавая на колонку следующие растворы: 0,02 М NaH2P04 (стартовый буферный раствор), 0,04 М фосфатный буферный раствор рН 5,8, 0,05 М фосфатный буферный раствор рН 6,2, 0,06 М фосфатный буферный раствор рН 6,6, 0,1 М фосфатный буферный раствор рН 7,2, 0,1 М фосфатный буферный раствор+0,5 М NaCl рН 9,5.

Элюирование ведут со скоростью 50 мл/ч, элюат собирают фракциями по 5—6 мл. Регистрация оптической плотности раствора осуществляется с помощью автоматического прибора с самописцем, например «Увикорда» фирма LKB. Каждый новый элюирующий раствор подают только после того, как полностью выйдет пик, вымываемый предыдущим.

3. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА КОЛОНКЕ С КМ-ЦЕЛЛЮЛОЗОЙ

А. Подготовка колонки. Колонку КМ-целлюлозы готовят так же, как колонку Ф-целлюлозы, но отмывка ионообменника несколько отличается; ее проводят следующим образом: 0,5 М NaOH, дистиллированной водой, 0,1 М уксусной кислотой, дистиллированной водой и стартовым буферным раствором.

Б. Хроматография. Фракционирование происходит так же, как и на колонке Ф-целлюлозы. Для последовательных ступеней элюирования рекомендуется применять следующие буферные растворы: 0,02 М ацетатный буферный раствор рН 4,6 (стартовый), 0,05 М ацетатный буферный раствор рН 5,2, 0,08 М ацетатный буферный раствор рН 6,0, 0,1 М фосфатный буферный раствор рН 7,0 и 0,1 М фосфатный буферный раствор +0,5 М NaCl рН 9,2.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Оптимальные размер колонки и количество наносимого белка для данного препарата катионообменника в каждом случае необходимо определить в предварительных экспериментах.

2. Катионообменные целлюлозы при регенерации обрабатывают так же, как при подготовке колонки к хроматографии.

В. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ НА КОЛОНКЕ С ДЭАЭ-СЕФАДЕКСОМ

Принцип метода. Белки, связанные на колонке с ДЭАЭ-сефа-дексом при данном значении рН, элюируют, снижая рН и увеличивая ионную силу элюента.

Область применения. Фракционирование на ДЭАЭ-сефадексе с успехом можно использовать во всех областях биохимии, белковой химии, иммунологии и клинической химии для выделения белковых фракций.

МЕТОДИКА

1. Подготовка колонки. Для анионообменной хроматографии

белков обычно применяют ДЭАЭ-сефадекс А-50. 1,0 г ионообменника

суспендируют в дистиллированной воде и оставляют на 1 ч, после

чего надосадочную жидкость вместе с медленно оседающими мелкими частичками декантируют. Затем ионообменник отмывают от ионов С1~ 0,5 М NaOH. Избыток щелочи отмывают дистиллированной

водой и продолжают дальнейшее отмывание кислотой. В связи с тем,

что белки сыворотки крови обычно фракционируют в фосфатном буферном растворе, в качестве кислого отмывающего раствора применяют 0,1 М фосфорную кислоту. Избыток кислоты в свою очередь отмывают дистиллированной водой, а затем ионообменник отмывают

стартовым буферным раствором до тех пор, пока не наступит равновесие. Проще всего отмывание вести фильтрованием на воронке

Бюхнера, поскольку при этом удобно не только отмывать, но и анализировать промывную жидкость.

Подготовить ДЭАЭ-сефадекс к хроматографии можно и другим способом: ионообменник на сутки оставляют набухать в большом избытке стартового буферного раствора, несколько раз меняя его. Если через сутки не наступит равновесие, то смену надосадочной жидкости продолжают до тех пор, пока ее рН не будет равен рН стартового буферного раствора.

2. Заполнение колонки ионообменником. К набухшему и уравновешенному стартовым буферным раствором ДЭАЭ-сефадексу добавляют немного буферного раствора и, закрыв выходное отверстие,

полученной негустой, тщательно перемешанной суспензией заполняют колонку, в которую предварительно на одну треть высоты наливают стартовый буферный раствор. Затем выходное отверстие

открыв

страница 88
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ручки дверные для межкомнатных дверей
как выдавить вмятину на заднем бампере на ребре рено логан
зеленые стулья для кухни
саломея билеты

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.08.2017)