химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

последним в реакцию, то рекомендуется проводить хроматографиюна ДЭАЭцеллюлозе в С1 "-форме. 1

2. ДЭАЭ-ЦЕЛЛЮЛОЗА В СГ-ФОРМЕ

а) Перевод ДЭАЭ-целлюлозы в С1~-форму. ДЭАЭ-целлюлозу в ОН "-форме, обработанную, как описано выше, и суспендированную в дистиллированной воде, перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре с 3 объемами 0,05 М трис-HCl рН 8. Суспензию оставляют отстаиваться и после декантации надосадочной жидкости дважды повторяют такое перемешивание. Затем ДЭАЭ-целлюлозу суспендируют в том же буферном растворе и заполняют ею колонку соответствующих размеров так, чтобы столбик ионообменника был гомогенным и не содержал пузырьков воздуха. После заполнения колонки ДЭАЭ-целлюлозу промывают вышеупомянутым буферным раствором до тех пор, пока электропроводность и рН элюата не достигнут показателей промывающего раствора. На этой стадии колонка готова к фракционированию.

б) Хроматография нативных белков на ДЭЛЭ-целлюлозе в С1~форме. Фракционируемый материал растворяют в небольшом объеме стартового буферного раствора (обычно 100 мг в 3—5 мл). Растворителем служит буферный раствор 0,05 М трис-HCl рН 8 (указанная

молярность относится к ионам С1~), в котором материал связывается с ионообменником. Раствор фракционируемого материала предварительно в течение 10 ч диализуют против этого же буферного раствора.

Осторожно удаляют из верхней части колонки буферный раствор над целлюлозой так, чтобы над ионообменником остался слой жидкости высотой не более 2—3_ мм. Раствор фракционируемого материала осторожно наслаивают на ДЭАЭ-целлюлозу круговыми движениями руки, прикасаясь загнутым кончиком пипетки к внутренней поверхности колонки. При наслаивании важно не взбалтывать частички ДЭАЭ-целлюлозы. Нанесенный раствор входит в ионообменник, и затем остатки наносимого материала трижды смывают со стенок верхней части колонки 0,5—1,0 мл 0,05 М буферного раствора.

При 0,05 М концентрации ионов С1" нативные белки хорошо связываются с ДЭАЭ-целлюлозой. Несвязавшиеся компоненты фракционируемой смеси удаляют, промывая колонку одним объемом буферного раствора.

в) Градиентное элюирование. Если фракционирование проводят

на колонке размером 1,5x35 см, то для элюирования достаточны

сосуды объемом по 100 мл, один из которых является смесителем,

а другой — резервуаром для буферного раствора. В смеситель заливают 0,1 М, в резервуар —0,5 М буферный раствор, соединяют

их тефлоновой или поливинил хлор идной трубкой, свободной от пузырьков воздуха, и подключают к колонке смеситель, стоящий на

магнитной мешалке.

С помощью винтового зажима на тефлоновой или поливинил-хлоридной трубке на выходе колонки устанавливают оптимальную скорость протекания жидкости, равную примерно 1 мл/мин.

Элюат собирают фракциями по 0,5—1,0 мл. Если есть соответствующий прибор, то производится непрерывная спектрофотомет-рия и регистрация оптической плотности элюата, а полученные фракции объединяют согласно вычерченному самописцем графику. При отсутствии автоматического проточного абсорбциометра все фракции элюата спектрофотометрируют при 280 нм, строят график изменения оптической плотности и по нему отбирают нужные фракции.

Определив экстинкцию исходного материала и полученных фракций, можно установить выход препарата в результате хроматогра-фического разделения.

3. ХРОМАТОГРАФИЯ НА ДЭАЭ-ЦЕЛЛЮЛОЗЕ В ПРИСУТСТВИИ

МОЧЕВИНЫ

Помимо хроматографии нативных белков, для решения ряда задач необходимо проводить хроматографическое разделение модифицированных (восстановленных, окисленных, карбоксимети-лированных, алкилированных и т. д.) белковых производных. Прежде всего это необходимо при определении аминокислотной последовательности тех белков, которые состоят из нескольких полипептидных цепей различной структуры. В этих случаях, прежде чем приступить к анализу последовательности аминокислот в полипептидных цепях, необходимо разделить последние.

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе в присутствии высокой концентрации мочевины является одним из лучших методов фракционирования денатурированных или химически модифицированных белков.

Подготовка ДЭАЭ-целлюлозы для хроматографии в С1 "-форме производится так же, как указано выше, но уравновешивание колонки, растворение фракционируемого материала и элюирование осуществляют буферными растворами, содержащими 8 М мочевину. В качестве стартового буферного раствора в данном случае используют буферный раствор трис-HCl рН 8, содержащий 0,05 М С1~ и 8 М мочевины. Чтобы предотвратить агрегацию и ассоциацию молекул фракционируемого материала в присутствии мочевины, к буферному раствору добавляют 0,1% додецилсульфата натрия. В полученном растворе, содержащем оба детергента (мочевину и додецил-сульфат натрия), растворяют фракционируемый материал, который диализуют против того же раствора в течение 24 ч.

Условия связывания фракционируемого материала и подбор градиента для элюирования не отличаются от описанных выше, однако все буферные растворы должны содержать 8 М мочевину.

Удаление мочевины. Почти всю

страница 84
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
оборудование для учебных машин
где можно купить бутсы в москве
Коллекторы FAR купить
смарт-контроллер сименс рдф 302

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.03.2017)