химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

ие и рН, и молярности

элюента.

При работе с КМ-целлюлозой в ЫН^-форме удобно реализовать

возможность (в), поскольку связывание со смолой в NH^- форме довольно слабое, и это позволяет вести элюирование в мягких условиях, не повреждая полипептидные цепи. При хроматографии на КМ-целлюлозе обычно используются буферные растворы с рН 4—6,5 и молярностью 0,01—0,5 М. Если, например, в качестве стандартного раствора выбран0,01 М аммонийацетатный буферный раствор рН 4, им же следует уравновесить КМ-целлюлозу. Однако иногда

при переводе ионообменника из Н+-формы в NH^-форму возникают затруднения. Чтобы ускорить этот процесс, рекомендуется предварительно отмытую КМ-целлюлозу в течение по меньшей мере 10 мин перемешивать с 10 объемами стартового буферного раствора. Суспензию оставляют для отстаивания и надосадочную жидкость декантируют. Размешивание в стартовом буферном растворе повторяют до тех пор, пока рН и электропроводность надосадочной жидкости не станут стабильными. После этого заполняют колонку КМ-целлюлозой в стартовом буферном растворе и уплотняют смолу до ее конечного объема.

В аналитическом варианте на колонку размером 1 X 30 см наносят 1—10 мг фракционируемого материала. Для препаративного разделения 50—100 мг материала необходима колонка размером 2х X 60 см.

4. Регистрация хроматографического разделения. Если фракционируемый материал содержит относительно много тирозиновых и

фенилаланиновых остатков, то довольно полную информацию о ходе хроматографии можно получить, определяя экстинкцию элюата

при 280 нм (Е28о) и строя соответствующий график.

Поглощение при 220 нм характеризует пептидные связи, однако если хроматография проводится в буферном растворе, содержащем соли аммония, то ориентироваться на этот показатель нельзя.

Если концентрацию фракционируемых веществ не удается определить спектрофотометрически, то полученные фракции можно подвергнуть щелочному гидролизу и проанализировать с помощью нингидриновой реакции (см. стр. 199).

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Почти однородная волокнистая или гранулярная КМ-целлюлоза обеспечивает сравнительно постоянную скорость протекания элюента через колонку. Однако если в суспензии ионообменника содержится много мелких частиц, то колонка постепенно забивается. Поэтому рекомендуется во время подготовки и регенерации ионообменника удалять мелкие, плохо оседающие частички смолы.

2. Для хроматографии удобно пользоваться аммонийформиатным или каким-либо другим летучим буферным раствором, поскольку полученные при этом фракции после лиофилизации можно использовать без предварительного обессоливания.

Е. ХРОМАТОГРАФИЯ ПЕПТИДОВ НА КОЛОНКЕ С ДЭАЭ-ЦЕЛЛЮЛОЗОЙ

Принцип метода. Группы —СН2—СН2—N+(C2H5)2 ДЭАЭ-цел-дюлозы обладают слабыми анионообменными свойствами в хлорид-ной, ацетатной и других формах.

Область применения. Аналитическое и микропрепаративное фракционирование крупных полипептидов.

МЕТОДИКА

1. Выбор типа целлюлозы. Все замечания, сделанные относительно типов КМ-целлюлозы, справедливы и для ДЭАЭ-целлюлозы (стр. 200). В дополнение к обычно рекомендуемым микрогранулярным препаратам ионообменников (например, DE 52 фирмы Whatman) мы советуем обратить внимание на сферическую ДЭАЭ-цел-люлозу, изготовляемую фирмой Reanal (Венгрия).

2. Обработка ДЭАЭ-цеЛлюлозы. Независимо от микроструктуры ионообменник обрабатывают следующим образом: сначала его перемешивают с 15-кратным количеством (сухой вес/объем) 0,5 н. НО 30 мин при комнатной температуре и на воронке или декантацией отмывают дистиллированной водой до рН 4. После этого ДЭАЭ-цел-люлозу 30 мин при комнатной температуре перемешивают с 15-кратным количеством 0,5 н. NaOH и отмывают дистиллированной водой, до тех пор пока суспензия не будет давать нейтральной реакции. Обработанную таким образом целлюлозу уравновешивают стартовым буферным раствором.

3. Подбор условий хроматографии. Для хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, как и на КМ-целлюлозе, не существует каких-либо общих стандартных условий. Подобно тому, как это делают при хроматографии на КМ-целлюлозе, мы можем подобрать для каждого конкретного материала оптимальные условия разделения: а) изменяя рН, б) увеличивая молярность и в) одновременно увеличивая молярность и изменяя рН буферного раствора.

Обычно хроматографию начинают при рН 7,5—8,0 и при концентрации иона О" или СН 3СОО" 0,01—0,005 М и заканчивают при рН 8,0—8,5 и концентрации элюента 0,5—0,75 М. Определенные преимущества имеет градиентное элюирование.

ДЭАЭ-целлюлозу уравновешивают так же, как и КМ-целлюлозу (см. стр. 200).

ПРИМЕЧАНИЯ

Нерастворимые в воде полипептиды можно фракционировать в буферных растворах, содержащих 6—8 М мочевины. Мочевину следует перекристаллизовать и обессолить на ионообменнике, поскольку соли, содержащиеся в препарате мочевины в качестве примесей, могут изменить ионную силу раствора, и хроматография станет плохо воспроизводимой. Особенно важно провести предварительную очистку мочевины, если молярность стартового буферного раствора низка (0,001—0,005 М).

Крупные п

страница 82
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
аренда проектора и экрана пенза
Рекомендуем фирму Ренесанс - чердачные лестницы складные - надежно и доступно!
кресло t 9950
Удобно приобрести в КНС Нева игровая видеокарта для компьютера - Санкт-Петербург, ул. Рузовская, д.11, тел. (812) 490-61-55.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(11.12.2016)