химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

итель для градиентного элюирова-ния заливают 150 мл дистиллированной воды, в резервуар — 0,2 н. уксусную кислоту и начинают наносить на колонку фракционируемый препарат.

2. Хроматография. Фракционируемый препарат готовят, как

указано выше (см. хроматографию на амберлите IR-4B, стр. 195),

подводят его рН до 5—6 и медленно наносят на колонку. После

Ионообменная хроматография пептидов

197

нанесения смолу промывают одним объемом дистиллированной воды, затем присоединяют прибор для градиентного элюирования, включают магнитную мешалку и начинают элюирование. Элюат собирают фракциями по 1 мл с помощью автоматического коллектора. За ходом элюирования следят по нингидриновой реакции, которую проводят на фильтровальной бумаге с каплями элюата, отбираемыми из каждой фракции.

Полученные фракции высушивают в вакуумном эксикаторе и анализируют с помощью электрофореза на бумаге. Фракции, обладающие одинаковой электрофоретической подвижностью, объединяют.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Если элюирование основных пептидов происходит слишком быстро, т. е. они выходят практически одной большой фракцией, следует сделать градиент концентрации Н+ более «пологим». Для этого можно либо увеличить объем смесителя, либо уменьшить концентрацию уксусной кислоты.

2. При промывании колонки дистиллированной водой после нанесения образца перед началом элюирования кислотой выходит весьма разбавленный элюат, содержащий нейтральные и кислые компоненты смеси пептидов.

В. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ПЕПТИДОВ НА КОЛОНКЕ С ДАУЭКСОМ 50x2 В НЕЛЕТУЧИХ БУФЕРНЫХ РАСТВОРАХ

Принцип метода. Дауэкс 50 х 2 со сниженным количеством перекрестных сшивок в Na+- или NH^"-форме связывает пептиды, состоящие из 2—20 аминокислотных остатков. Постепенно увеличивая рН и ионную силу подаваемого на колонку раствора, можно избирательно элюировать связанные пептиды.

Область применения. Препаративное разделение пептидов, анализ последовательности аминокислот в полипептидах и белках.

МЕТОДИКА

1. Приготовление буферных растворов1. Аммонийформиатный буферный раствор рН 3,08 : 0,75 н. муравьиная кислота+0,2 н. NH4OH.

1 Указанная молярность соответствует конечной концентрации данного компонента буферного раствора.

Аммонийацетатный буферный раствор рН 5,06:1,47 М уксусная кислота + 1 н. NH4OH.

Натрий цитр атный буферный раствор рН 3,1 : 0,1 М лимонная кислота + 0,2 н. NaOH +0,138 н. НС1.

Натрийцитратацетатный буферный раствор рН 5,1 (1 н. Na+): 0,25 М лимонная кислота+0,179 н. уксусная кислота+ 0,57 н. NaOH + 0,5 н. ацетат натрия.

Натрийцитратацетатный буферный раствор рН 5,1 (2н. Na+): 0,5 М лимонная кислота +0,358 н. уксусная кислота+1,14 н. NaOH + 1 н. ацетат натрия.

Натрийцитратацетатный буферный раствор рН 4,3: разбавленный в 5 раз буферный раствор рН 5,1+0,2 н. буферный раствор рН 3,1 (1:1).

2. Подготовка смолы, а) Получение смолы в Na?-форме. Смолу суспендируют в 0,25.н. НС1 и перемешивают сначала при комнатной температуре, а затем при 60—70° С в водяной бане. Через

60 мин перемешивания суспензию охлаждают до комнатной температуры, надосадочную жидкость удаляют, смолу трижды отмывают

дистиллированной водой и суспендируют в 0,25 н. NaOH. Полученную суспензию снова нагревают до 60—70° С в водяной бане с

перемешиванием в течение 1 ч, затем охлаждают и отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции.

б) Получение смолы в NН+^форме. Сначала смолу отмывают щелочью, затем кислотой. Отмытую от хлоридов смолу в Н+-форме суспендируют в 0,25 н. NH4OH, перемешивают при 60—70° С в течение 1 ч и отмывают до нейтральной реакции дистиллированной водой.

3. Заполнение колонки. В колонку размером 1,8 х 150 см, снабженную термостатирующей рубашкой, заливают немного буферного раствора рН 3,1. Смолу суспендируют в том же буферном растворе,, подогретом до 50° С, и после тщательного перемешивания освобожденную от воздуха под вакуумом суспензию загружают в колонку. Следует заполнять колонку таким образом, чтобы над смолой всегда оставалось немного буферного раствора, обеспечивающего свободное оседание частичек смолы. Заполнение заканчивают, когда уровень смолы окажется на 10 см ниже верхнего конца термостатирующей рубашки.

4. Нанесение препарата. Около 200 мг фракционируемой смеси пептидов растворяют в 25—30.мг дистиллированной воды, муравьиной кислотой подводят рН раствора до 2, затем добавляют 25—30 мл буферного раствора рН 3,1 и наносят на колонку.

5. Хроматография. Пептиды фракционируют с помощью градиентного элюирования. Стартовый буферный раствор имеет рН 3,1^ Смеситель содержит 2500 мл 0,5 н. буферного раствора рН 5,1. Элю-ат, вытекающий из колонки, собирают фракциями по 10 мл-Нингидриновую реакцию ставят либо непосредственно с полученным элюатом, либо после его щелочного гидролиза.

Щелочной гидролиз. Из каждой фракции отбирают по 0,3 мл, перемешивают с 1 мл 2,5 н. раствора NaOH и инкубируют при 90° С в водяной бане 2,5 ч. За это время концентрация препаратов увеличивается. К каждой пробе прибавляют по 1 мл 30%-ной уксусной кислоты и проводят нингидр

страница 80
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
grundfos mtr 3
нтв помощь больным детям
подушка симфония
авизор комфорт дропс купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(13.12.2017)