химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

антисыворотки, как описано на стр. 131. Центральная лунка в диаметре должна примерно в 4 раза превышать расположенные на равном расстоянии от нее периферические лунки (12—1§ и 3-^4 гам соответетвенно). Две соседние периферические дунки далжны -аштоязь яруг :от друга дальше, чем от центральной лунки.

2. Титрование антигена. В центральную лунку заливают 0,2 мл иммунной сыворотки, агаровую пластинку помещают во влажную камеру и оставляют при 37°С на 24—72 ч. В результате диффузии иммунной сыворотки от центральной лунки по направлению к периферическим возникает градиент концентрации антител.

По истечении времени, достаточного для образования градиента концентрации антител, в периферические лунки заливают заранее

приготовленные препараты исследуемого антигена в соответствующем разведении. В каждую лунку с помощью микропипетки или капиллярной пипетки, имеющей метку, вносят строго один и тот же объем раствора.

Через 24 ч повторной инкубации во влажной камере при 37°С в агаровом геле вокруг периферических лунок образуются полосы (или кольца) преципитации. Регистрируя их, определяют наибольшее разведение антигена, при котором еще наблюдается реакция преципитации, и принимают его за титр исследуемого антигена.

ПРИМЕЧАНИЯ

Существует другой, менее чувствительный метод титрования антигена или антител, также- разработанный Фейнбергом и заключающийся в следующем.

Специфическую иммунную сыворотку при титровании антигена или раствор известного антигена при титровании антисыворотки смешивают с расплавленным агаром и выливают на дно чашки Петри.

После затвердения агара в геле вырезают лунки и заполняют их раствором антигена или антисыворотки. Диффундируя в геле, антиген или антитела встречаются с соответствующим специфическим партнером, что приводит к весьма быстрому появлению колец преципитации вокруг лунок. Реакцию можно учитывать уже через 30 мин, но окончательную оценку следует проводить через 24 ч инкубации при 37°С во влажной камере. Ошибка этого метода количественного определения антигенов и антител составляет ±25%. Точность метода повышается, если ставить много параллельных проб.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВОГО АНТИГЕНА В СЛОЕ АГАРОВОГО ГЕЛЯ, СОДЕРЖАЩЕГО СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА [5]

Принцип метода. Исследуемый белковый антиген, диффундируя из лунки, образует в агаровом геле, содержащем моноспецифические антитела, преципитат & виде кольца, диаметр которого пропорционален концентрации этого антигена.

Область применения. Количественное определение белков, определение концентрации индивидуальных компонентов белковой смеси (например, сыворотки крови).

МЕТОДИКА

1. Приготовление агаровой пластинки, содержащей антитела. Готовят 3%-ный агар на 0,03 М калий-фосфатном буферном растворе рН 8,0, содержащем 0,1 М NaCl, и помещают его в водяную баню при 56°С. Соответствующую моноспецифическую антисыворотку разбавляют в зависимости от титра фосфатным буферным раствором (см. примечание 2) и нагревают также до 5брС. 8 мл нагретого 3%-ного агара и 8 мл подогретой антисыворотки смешивают при 56°С и 15 мл смеси наливают на стеклянную пластинку размером 8 х 10 см, расположенную на горизонтальной поверхности. После затвердения агара пластинку помещают во влажную камеру и хранят в холодильнике до использования. (Рекомендуется к смеси агара и антисыворотки добавлять мертиолат в разведении 1 : : 10 000.)

2. Приготовление лунок для исследуемого антигена. При помощи подходящего инструмента (см. стр. 131) в агаровом геле вырезают лунки для антигена диаметром 2,4 мм, расположенные на расстоянии 12 мм друг от друга. Обычно на углах пластинки поверхность агара получается недостаточно ровной и образующиеся кольца преципитации не имеют правильных очертаний, поэтому четыре угловых лунки оставляют пустыми.

3. Заполнение, лунок. Часть лунок в агаровом геле заполняют капиллярной пипеткой заранее приготовленными растворами белка известной концентрации в соответствующих разведениях. В оставшиеся лунки наливают исследуемые образцы белковых смесей, например сыворотки крови. Следует тщательно следить за тем, чтобы во всех лунках был налит одинаковый объем растворов, заполняющий их точно до краев. После этого агаровую пластинку помещают во влажную камеру и на 24 ч оставляют в холодильнике.

4. Оценка результатов. В агаровом геле, содержащем моносгге-цифические антитела и диффундирующий антиген, образуются кольца преципитации. Диаметр такого кольца проще всего измерить, рассматривая его на темном фоне с подсветкой под определенным углом. Сначала измеряют диаметры преципитационных колец вокруг лунок с разведенными стандартными растворами белка и строят график зависимости этих величин (в мм) от логарифма концентрации раствора. Измерив диаметры преципитационных колец вокруг лунок исследуемых образцов, с помощью полученной калибровочной кривой определяют концентрации анализируемого белка.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Для успешного осуществления этого метода основное значение имеют два момента. Во первых, наличие иммунохимически чистого (т

страница 66
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
узлы обвязки вентиляции
электропривод siemens hvac sqs65 24v, dc: 0/10v
скамейка парковая родник
https://wizardfrost.ru/info/Stanciya_metro_Voykovskaya-remont_xolodilnikov_na_domu

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.06.2017)