химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

анализа малых количеств материала.

МАКРОМЕТОД ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПО ГРАБАРУ

И ВИЛЬЯМСУ 18, 9]

ПРИБОРЫ

1. Источник тока. Необходим источник, дающий ток до 100 мА при стабилизированном напряжении 100—150 В.

2. Прибор для электрофореза. Прибор состоит из двух плексигласовых ванн размером 400 х 40 х 70 мм, в которые вмонтированы платиновые электроды длиной 400 мм и диаметром 0,5—0,8 мм. В торцовой части каждой ванны имеются выходные отверстия, соединенные резиновым шлангом. В ванны электрофоретического прибора заливают по 1 л буферного раствора. Во время электрофореза следует обеспечить постоянный поток буферного раствора через прибор. Для этого выше уровня ванн помещают бутыль емкостью 4—5 л, из которой буферный раствор поступает в ванны, вытекая затем через выходные отверстия в торцовой части.

МЕТОДИКА

/. Приготовление буферного раствора. Иммуноэлектрофорез белков проводят обычно в буферном растворе Михаэлиса, имеющем рН 8,2 и ионную силу 0,05.

Буферный раствор Михаэлиса готовят следующим образом: 47,6 г диэтилбарбитурата натрия растворяют в 3000 мл дистиллированной воды, имеющей рН 7, и подкисляют сначала примерно до рН 8,4 65 мл 1 н. НС1, а затем осторожно до рН 8,2. После этого добавляют дистиллированную воду до конечного объема 4265 мл. Если необходимо получить буферный раствор меньшей ионной силы, производят дальнейшее разбавление.

2. Приготовление агаровой пластинки. 1,5%-ный агаровый гель готовят на указанном выше буферном растворе (очистка агара и приготовление геля описаны на стр. 127).

Обычно иммуноэлектрофорез проводят в слое агарового геля на стеклянных пластинках размером 180 х 130 мм, которые следует перед опытом тщательно вымыть, обезжирить, высушить и расположить строго горизонтально; любое отклонение пластинки от горизонтального уровня приводит к неравномерности толщины агарового геля. Рекомендуется применять следующий прием: стеклянную кювету соответствующего размера заполняют 5%-ным расплавленным агаром; после его затвердения образуется горизонтальная поверхность, на которую и помещают стеклянную пластинку. Для того чтобы положение пластинки всегда было строго горизонтальным, после затвердения агара кювету не следует сдвигать с места.

На оба края стеклянной пластинки накладывают полоски смоченной буферным раствором фильтровальной бумаги шириной 40 мм так, чтобы они на 30 мм выступали за край стекла.

Затем на поверхность стекла на расстоянии 31 мм одна от другой параллельно кладут стеклянные палочки или трубки диаметром 5 мм, на месте которых после затвердения агара образуются канавки для внесения антисывороток.

Расплавив 250—300 мл агара, его наливают на подготовленную стеклянную пластинку с полосками фильтровальной бумаги таким образом, чтобы образовался слой геля толщиной 3—4 мм^ Следует наносить агар аккуратно, избегая появления пузырьков воздуха. После затвердения агара двумя пинцетами удаляют стеклянные палочки и по обе стороны каждой канавки на расстоянии 8 мм от нее вырезают лунки для внесения исследуемых образцов. Лунки размером 3 х 15 мм вырезают при помощи скальпеля, лезвия или специального инструмента из стекла или металла. Вырезанные столбики агарового геля осторожно извлекают из лунок, поддев снизу или отсасывая их иглой большого диаметра (фиг. 26).

Затем агаровый гель обрезают по контуру стеклянной пластинки и полосок фильтровальной бумаги так, чтобы покрытые гелем

полоски можно было отогнуть книзу под прямым углом к плоскости пластинки.

Готовую агаровую пластинку закрепляют в приборе для электрофореза и покрытые гелем фитили фильтровальной бумаги погружают в буферный раствор, заполняющий ванны.

При помощи расплавленного агара восстанавливают целостность геля в местах его случайных повреждений, чтобы обеспечить одинаковую электропроводность всех участков.

3. Внесение исследуемого образца. Раствор, содержащий примерно 15 мг исследуемого белка (например, при исследовании сывороУ

а г"

CZ

~г )

88,5

1*.

30

10

10

30

180

Фиг. 26. Приготовление агаровой пластинки для иммуноэлектрофореза (макрометод).

а — слой агарового геля; б — полоски фильтровальной бумаги; в — лунки для исследуемых образцов (/, 2, 3, 4); г — канавки для иммунной сыворотки. (Размеры даны в мм.)

точных белков — 0,2 мл сыворотки крови), подогревают до 40°С и смешивают с0,8 млЗ%-ного расплавленного агара, приготовленного на дистиллированной воде и охлажденного до 40°С. Полученную смесь вносят в лунку для исследуемого образца на агаровой пластинке. Оставшийся свободный объем лунки заполняют 1,5%-ным агаровым гелем в буферном растворе. При заполнении лунки следует избегать образования пузырьков воздуха.

4. Электрофорез. При напряжении 120 В электрофор ети чес кое разделение белков сыворотки крови продолжается 4—-5 ч. Оптимальный градиент напряжения 3—6 В/см. В этих условиях можно проводить электрофорез без специального охлаждения и в то же время не опасаться высыхания геля. При увеличении силы тока происходит падение напряжения, поэтому необходимо несколь

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
vip трансфер в аэропорт
метки-транспондеры
номерная рамка с защитой от камер
Фирма Ренессанс деревянная лестница на второй этаж - качественно и быстро!

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.02.2017)