химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

ьтрацией или диализом. Число связанных карбэтоксильных групп можно определить спек-трофотометрически; их коэффициент молярной экстинкции при 240 нм равен 3 260 [9].

Затем карбзтоксилированный белок гидролизуют каким-либо ферментом, функционирующим в интервале рН от 6 до 8. Вне этого интервала карбэтоксильные связи нестабильны. Удобнее всего вести гидролиз в автотитраторе при тщательном перемешивании и непрерывном добавлении щелочи, поддерживая рН смеси на постоянном уровне и не допуская локального защелачивания.

Ферментативный гидролизат лиофилизируют и затем подвергают электрофорезу. При рН 5 гистидин полностью ионизирован, поэтому наибольшего различия в электрофоретической подвижности между пептидами, содержащими гистидин и карбэтоксигистидин, следует ожидать именно в этих условиях. В связи с этим электрофорез обычно проводят при рН 5. После окрашивания контрольной полоски вырезают аналитическую электрофореграмму, помещают ее в эксикатор над 5 н. раствором аммиака и инкубируют при комнатной температуре 6 ч.

После инкубации электрофореграмму высушивают и снова подвергают электрофорезу при рН 5 в перпендикулярном направлении. В парах аммиака происходит отщепление карбэтоксильных групп, гистидиновые остатки становятся доступными протонированию, и при электрофорезе пептиды, содержащие гистидин, смещаются от занимаемого другими пептидами диагонального положения в сторону катода.

Установив с помощью аналитического диагонального электрофореза локализацию зоны пептидов с гистидином на препаративной электрофореграмме, ее вырезают и после обработки парами аммиака вновь подвергают электрофоретическому разделению в препаративном масштабе.

4. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ ЛИЗИН

Анализ пептидов, содержащих лизин, из ферментативного (но не триптического!) или частичного химического гидролизата является важным этапом расшифровки аминокислотной последовательности белков. Выделение пептидов, содержащих лизин, следует начать с обратимого блокирования в-аминогрупп остатков лизина в исследуемом белке. Такую обратимую модификацию можно получить при трифторацетилировании [5], малеинировании [2] или цитраконилировании [41.

Перед трифторацетилированием SH-группы исследуемого белка карбоксиметилируют или окисляют надмуравьиной кислотой. 100 мг белка растворяют в 10 мл 8 М раствора мочевины и к этому раствору при тщательном перемешивании в три приема добавляют 3 мл этилтиотрифторацетата, поддерживая рН около 10 с помощью 5 н. раствора NaOH. После внесения последней порции этилтиотрифторацетата рН понижают до 6 и удаляют мочевину и избыток реагента, диализуя смесь против дистиллированной воды или 1%-ного раствора бикарбоната аммония. В результате трифтораце-тилирования е-аминогруппы остатков лизина блокируются трифто-рацетильными группами, и поэтому они не могут быть протониро-ваны. Далее модифицированный белок подвергают ферментативному гидролизу, следя за тем, чтобы рН не превысил 8,2, так как в более щелочной среде трифторацетильные группы отщепляются. Гидролизат подвергают электрофоретическому разделению, затем из электрофореграммы вырезают полоску для аналитического диагонального электрофореза и помещают ее на 4 ч в эксикатор над 5 н. раствором аммиака. В щелочной среде происходит отщепление трифтор ацетильных групп и регенерация г-аминогрупп, которые вновь становятся доступными протонированию. В результате протонирования заряд каждого остатка лизина изменяется на +1 единицу. Поэтому при электрофорезе происходит смещение пептидов, содержащих лизин, от диагонального положения остальных компонентов по направлению к катоду [10].

Обратимое блокирование е-аминогрупп можно также получить в результате реакций малеинирования или цитраконилиро-вания. В этих реакциях происходит включение карбоксильной группы в в-аминогруппу с изменением ее заряда.

Для малеинирования исследуемый белок растворяют в 8 М мочевине, содержащей 0,1 М пирофосфата, до концентрации 10 мг/мл. В этот раствор вносят одну каплю фенолфталеина и в три приема добавляют 30 молярных эквивалентов чистого малеинового ангидрида (в расчете на количество аминогрупп), тщательно перемешивая раствор. Непрерывно подавая 10%-ный раствор NaOH, рН этой смеси постоянно поддерживают в зоне перехода окраски фенолфталеина. По окончании реакции (через 10—12 мин) мочевину удаляют диализом против дистиллированной воды или гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25 (крупнозернистый).

Реакцию цитраконилирования проводят так же, как и реакцию малеинирования, в 8 М растворе мочевины, содержащем 10 мг/мл белка, в автотитраторе. Величина рН поддерживается на постоянном уровне с помощью непрерывной подачи 10%-ного раствора NaOH. К раствору белка в три приема при тщательном перемешивании прибавляют 30 молярных эквивалентов цитраконового ангидрида (в расчете на количество аминогрупп). В конце реакции смесь обессоливают диализом или гель-фильтрацией.

Для ферментативного гидролиза малеинированных и цитра-конилированных белков можно использовать почти все протео-литические ферм

страница 46
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
металлочерепица modern
Скалки Joseph Joseph
купить наклейки на день свитово валинтина
какие машины относятся к классу комфорт в такси

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.06.2017)