химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

поверхность стеклянной пластинки заливают сверху очень тонким слоем расплавленного агара (1,5%-ный агар в буферном растворе). Этот слой агара должен фиксировать бумажные полоски и предотвратить прилипание к стеклу основного слоя агара, который наносят во вторую очередь.

Как только первый тонкий слой агара затвердеет, на стекло наносят основной поддерживающий слой 1,5%-ного расплавленного агара в вероналовом буферном растворе рН 8,6. Этот слой должен иметь толщину 3—4 мм и покрывать всю поверхность стекла и полоски фильтровальной бумаги. Для этого требуется примерно .250—300 мл расплавленного агара.

После затвердения агара его подравнивают по контуру пластинки и полосок фильтровальной бумаги с помощью лезвия бритвы или острого скальпеля. Для дальнейшей обработки пластинку помещают на специальную подставку, например деревянный брусок или коробочку, имеющую ширину и высоту приблизительно 10 см. После того как пластинку приподнимут, прикрепленные к ней с обеих сторон и покрытые сверху агаром бумажные полоски будут свисать под прямым углом. При закреплении пластинки в электрофоретической камере эти полоски погружаются в буферный раствор. Чтобы обеспечить равную электропроводность во всех участках агарового слоя, необходимо восстановить его целостность в местах перегиба бумажных полосок на краях пластинки. Это делают в последнюю очередь, осторожно заливая пипеткой расплавленный агар в те места, где произошло повреждение слоя.

Прежде чем закрепить пластинку с агаром в электрофоретической камере, в агаровом слое вырезают лунки для внесения исследуемого материала. Обычно эти лунки имеют размер от 3 до 15 мм и располагаются на расстоянии 12—15 мм одна от другой. Их вырезают лезвием, скальпелем или специальным инструментом из стекла или металла, предназначенным для этой цели. Кусочки вырезанного агара удаляют, подцепив их крючком снизу или отсасывая шприцом с большой канюлей.

4. Внесение исследуемого материала. Приготовленную пластинку с агаром закрепляют в электрофоретической камере. Свисающие с ее концов покрытые в верхней части агаром полоски фильтровальной бумаги погружают в буферный раствор.

0,2 мл исследуемой сыворотки разбавляют 0,3 мл дистиллированной воды, подогревают до 40° С и смешивают с 0,5 мл 3%-ного расплавленного агара (приготовленного на дистиллированной воде), охлажденного до 40° С. Нагретой пипеткой эту смесь заливают в лунку, сделанную в агаре. После внесения образцов оставшееся в лунках пространство заполняют 1,5%-ным агаром, приготовленным на буферном растворе. Необходимо следить за тем, чтобы расплавленный агар был полностью свободен от пузырьков воздуха.

5. Электрофорез. При градиенте напряжения 6 В/см фракционирование сыворотки крови продолжается 4—5 ч. Во время электрофореза температура агара не поднимается выше 30° С, поэтому специальных приспособлений для охлаждения не требуется.

6. Фиксация белков. Как только электрофорез закончился, полоски фильтровальной бумаги, свисающие с концов пластинки, обрезают ножницами, а пластинку с агаром погружают на 1 ч в 2%-ный раствор уксусной кислоты. В результате этой процедуры в агаре можно отчетливо наблюдать зафиксированные белковые фракции.

7. Высушивание агарового слоя. После фиксации слой агара сверху накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в дистиллированной воде. Бумагу следует разгладить на поверхности агара, чтобы между ней и агаром не было пузырьков воздуха. Затем агаровый слой оставляют на ночь при 37° С для подсушивания. После высушивания бумагу удаляют и агаровый слой окрашивают одним из предлагаемых методов.

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ АГАРОВЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММ

ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ АМИДОВЫМ ЧЕРНЫМ IOB

Окрашивающий раствор: 1,0 г амидового черного растворяют в 900 мл ацетатного буферного раствора. Ацетатный буферный раствор готовят смешиванием 500 мл 1 М уксусной кислоты (60 г/л), 500 мл 0,1 М CH3COONa • ЗН20 (13,6 г/л) и 100 мл глицерина.

Отмывающий раствор: смешивают 830 мл дистиллированной воды, 20 мл уксусной кислоты и 150 мл глицерина. После окрашивания в течение 5 ч агаровые пластинки отмывают, меняя каждые 20 мин отмывающий раствор, пока не содержащие белка участки агара не освободятся от красителя.

Во время окрашивания слой агара отклеивается от стекла. После того как отделившиеся агаровые пластинки окрасятся, их помещают на стекло и высушивают при комнатной температуре.

ОКРАШИВАНИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ СУДАНОМ ЧЕРНЫМ

Окрашивающий раствор: 1,2 г судана черного растворяют в смеси, содержащей 400 мл абсолютного спирта, 380 мл дистиллированной воды и 20 мл 25%-ного раствора NaOH. Раствор доводят до кипения и охлаждают.

Отмывающий раствор: 50%-ный этанол. После окрашивания в течение 2 ч агаровые пластинки отмывают, дважды погружая на 15 мин в отмывающий раствор. Если окрашенный препарат поме

стить на 5 ч в 15%-ный водный раствор глицерина, происходит отделение агаровой пластинки от стекла.

Количественное определение белков при электрофорезе в агаре. Процентное содержание полученных фракций можно определить фотоэлек

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
inmotion v3 pro купить
http://dveripandora.ru/catalog/mezhkomnatnye-dveri/italyanskaya-legenda/massiv-duba/d-3-st/
шкаф металлический для спецодежды шр-33, 500х900х1850 мм
https://wizardfrost.ru/remont_model_11031.html

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.06.2017)