химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

в несколько кристалликов тимола.

2. Метилцеллозольв (монометиловый эфир этиленгликоля).

3. Пропанол-водная смесь (смесь равных объемов н-пропанола и дистиллированной воды).

4. Нингидриновый реактив. Приготовление нингидринового реактива: 40 мг SnCl2 ? 2Н20 растворяют в 25 мл цитратного буферного раствора и добавляют 4,0 мг нингидрина, предварительно растворенного в 12,5 мл метилцеллозольва. Реактив готовят непосредственно перед опытом.

Методика. 0,1 мл исследуемого раствора белка вносят пипеткой в пробирку на 5 мл со шлифом и прибавляют 0,5 мл нингидринового реактива; закрывают стеклянной пробкой, тщательно перемешивают и 20 мин кипятят на водяной бане. Затем прибавляют 2 мл пропанол-водной смеси, раствор перемешивают, центрифугируют и определяют оптическую плотность надосадочной жидкости при 570 нм.

В контрольной пробе все операции проводят с 0,1 мл дистиллированной воды.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА С ПОМОЩЬЮ АМИДОВОГО ЧЕРНОГО [9, 10]

' Принцип метода. Амидовый черный связывается белками пропорционально количеству белка.

Чувствительность метода. Метод применим для исследования образцов, содержащих не менее 0,01 мг белка. С его помощью довольно удобно определять концентрацию белков в растворах с малым содержанием белка, например в спинномозговой жидкости, в водянистой влаге глаза и т. д.

Реактивы. 1. Раствор красителя: насыщенный раствор амидового черного 10 В в охлажденной смеси ледяная уксусная кислота— метанол (1:9) (см. стр. 49).

2. Отмывающий раствор: смесь ледяная уксусная кислотаметанол (1 : 9).

3. Растворитель: 0,1 н. NaOH.

Методика. К 0,2 мл исследуемого раствора белка (в центрифужной пробирке) добавляют 1,0 мл дистиллированной воды, затем пипеткой в пробирку вносят сначала 1, а затем после тщательного перемешивания еще 4 мл красителя. Встряхивают несколько раз и оставляют смесь на 20 мин при комнатной температуре; центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин, надосадочную жидкость осторожно сливают или отсасывают пипеткой. Осадок промывают отмывающим раствором до тех пор, пока надосадочная жидкость после очередного центрифугирования не останется бесцветной. Отмытый осадок растворяют в 5 мл растворителя и измеряют оптическую плотность в 1-сантиметровой кювете со светофильтром S-61 при 595 нм против контроля. Величина экстинкции, умноженная на 105, дает величину концентрации белка в мг%.

Б. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА АЦЕТАТ-ЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ

МЕМБРАНЕ [15]

Принцип метода. Белки, нанесенные на смоченную буферным раствором ацетат-целлюлозную мембрану, мигрируют в электрическом поле в соответствии с общим зарядом их молекул.

Область применения этого метода та же, что и электрофореза на бумаге.

ПРИБОРЫ

1. Камера для электрофореза. На фиг. 6 схематически представлена камера, которую предложил Кон [15] специально для электрофореза на ацетат-целлюлозной мембране.

2. Источник тока: см. стр. 46.

МЕТОДИКА

1. Приготовление буферного раствора: см. стр. 47.

2. Заполнение электрофоретической камеры буферным раствором. Буферный раствор наливают в камеру до уровня 2 см в высоту.

3. Увлажнение мембраны. Держа мембрану двумя пинцетами, медленно и постепенно погружают ее в буферный раствор. Скорость погружения не должна превышать скорости смачивания мембраны. При слишком быстром погружении могут образоваться пузырьки воздуха, мешающие электрофоретическому разделению. После смачивания мембраны избыток буферного раствора удаляют фильтровальной бумагой.

4. Закрепление мембраны в приборе. Оба конца влажной мембраны кладут на нижнюю часть специального держателя в камере.

; z 7

Затем между верхней частью держателя и мембраной с обеих сторон помещают полоски фильтровальной бумаги. Опуская верхнюю часть зажима на нижнюю, растягивают и фиксируют мембрану, одновременно прижимая к ней полоски фильтровальной бумаги, которые опускаются в буферный раствор и выполняют роль проводников электрического тока (фиг. 6).

5. Нанесение исследуемого образца. Капиллярной пипеткой наносят 5 мкл сыворотки приблизительно в центр растянутой мембраны. Проще всего к центру мембраны приложить линейку и вести вдоль нее кончик пипетки, так чтобы сыворотка впитывалась в мембрану по прямой линии, не доходя 3 мм до краев мембраны. После нанесения камеру закрывают крышкой.

6. Электрофорез. Электрофорез продолжается 2 ч при комнатной температуре и градиенте напряжения 10—12 В/см.

7. Высушивание и окрашивание мембраны. После окончания электрофореза мембрану извлекают из камеры, пластмассовыми зажимами закрепляют на стеклянной палочке и высушивают сначала при комнатной температуре, а затем при 100°С в течение 5 мин. На последнем этапе белки на мембране фиксируются.

Окрашивать ацетат-целлюлозную мембрану можно так же, как бумажную электрофореграмму (см. стр. 54), либо используя пунцовый S (см. стр. 73).

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Описанный микроэлектрофорез на ацетат-целлюлозной мембране позволяет анализировать от 5 до 1000 мкг белка, при этом разделение происходит лучше, чем при электрофорезе на бумаге. Значитель

страница 30
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
бухгалтерские курсы для начинающих на выхино
светленз 38 светлый аква
аренда ноутбука в москве
97290-010

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)