химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

им следует уже окончательная очистка пептидов с помощью электрофореза, ионообменной или иной хроматографической процедуры.

Предварительное разделение смеси пептидов в соответствии с их электростатическим зарядом можно осуществить с помощью свободного ионофореза (или многокамерного электрофореза), который успешно применяли Сэнгер и Туппи [72]. Однако этот метод в настоящее время полностью вытеснен гель-фильтрацией, т. е. разделением в соответствии с размерами молекул. После появления первых работ в этом направлении [44, 83] чрезвычайно полезный метод гель-фильтрации был разработан Поратом и Флодиным [61 ]; позднее Флодин теоретически обосновал его [20].

При гель-фильтрации наиболее употребительны два типа гелей: гели, полученные путем ферментирования декстрана (сефадексы), и синтетические гели акриламида (биогели). Акриламидные гели обладают низкой адсорбционной способностью, поэтому при равной разрешающей способности для них характерен больший выход фракционируемого вещества, чем для гелей декстрана.

После предварительного фракционирования дальнейшую очистку смеси пептидов удобно производить с помощью электрофореза на бумаге. Существует четыре разновидности этого метода: 1) вертикальный электрофорез на бумаге без охлаждения [51 ]: 2) вертикальный электрофорез на бумаге с охлаждением толуолом [50]; 3) горизонтальный электрофорез на бумаге с охлаждением типа «сэндвич» [25]; 4) горизонтальный электрофорез на бумаге с охлаждением подложки [10].

С помощью горизонтального электрофореза на бумаге можно проводить анализ смеси пептидов методом «отпечатков пальцев» и выделять микроколичества различных фракций. Для решения этих задач удобен электрофорез на бумаге в двух буферных растворах, который позволяет в одноэтапном эксперименте четко разделить кислые и основные компоненты смеси [8]. После гидролиза средней продолжительности в реакционной смеси обычно присутствует смесь кислых и основных пептидов. Одновременная подача двух разных буферных растворов способствует более полному разделению таких пептидов.

Применение при электрофорезе летучих буферов позволяет сразу же после высушивания бумаги элюировать разделенные пептиды и проводить их дальнейшее фракционирование.

Из летучих буферов чаще всего используют системы пиридин — уксусная кислота и уксусная кислота—муравьиная кислота с величинами рН 6,5; 3,5 и 1,9.

В ходе очистки вслед за электрофорезом при разных значениях рН для разделения пептидов применяется хроматография набумаге.

Общепринято определять пептиды с помощью нингидриновой реакции. Добавление Cd2+ к раствору нингидрина не только увеличивает ее чувствительность, но и повышает стабильность окрашивания. N-ацильные пептиды можно выявлять в реакции с хлором [67]. Некоторые аминокислоты выявляются реакциями специфического окрашивания, например гистидин — реакцией Паули, аргинин — реакцией Сакагуши. С помощью этих же реакций можно обнаруживать и пептиды, содержащие гистидин и аргинин.

Если электрофорез и хроматографию на бумаге можно отнести к микропрепаративным методам, то метод разделения смеси пептидов с помощью ионообменной хроматографии следует, пожалуй, считать макропрепаративным. Его главное преимущество заключается в том, что он позволяет обрабатывать большие количества материала и получать несомненно большие выходы фракций. Применение при ионообменной хроматографии летучих буферов дает возможность избежать трудоемкой процедуры обессоливания, которая осложняла ранее предложенные методики [49, 92]. Большим достижением в области ионообменной хроматографии является введение сферических смол. Их применение способствует увеличению скорости потока фракционируемых веществ через колонку и значительно сокращает продолжительность препаративного разделения. Сферические смолы в автоматических аминокислотных анализаторах обеспечивают воспроизводимую сравнительную хроматографию пептидов с высокой разрешающей способностью, т. е. позволяют автоматически проводить анализ методом «отпечатков пальцев».

Ключевая роль в расшифровке последовательности принадлежит определению концевых аминокислот, имеющих либо свободную NH2-rpynny на N-конце, либо свободную СООН-группу на С-конце пептида. Именно поэтому классический метод Сэнгера явился значительным достижением в белковой химии; его принцип заключается в следующем. Анализируемый белок или пептид в очень мягких условиях обрабатывают 2,4-динитрофторбензолом (ДНФБ). В результате происходит динитрофенилирование N-концевых аминогрупп, а также некоторых реакционноспособных боковых цепей, имеющих следующие группы: e-NH2, фенольные — ОН, имида-зольные —NH и —SH. После этого динитрофенильные (ДНФ) производные белков или пептидов подвергают кислотному гидролизу и экстрагируют эфиром а-ДНФ-аминокислоты, занимавшие в белке или пептиде N-концевое положение. После экстракции в гидролизате остаются только водорастворимые ДНФ-аргинин и ДНФ-лизин. Затем хроматографическим анализом эфирного экстракта точно устанавливают концевую аминокислоту, используя колоночную

[1,62], б

страница 16
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
аренда микроавтобуса 30 мест в москве
nvidia quadro
зашпаклевать кантик заднего багажника
билет на квн в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.09.2017)