химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

ю группировку и превращается в Орн, Цис разрушается, а Мет окисляется в соответствующий сульфон.

2. При коротком гидразинолизе может отщепиться С-кон-цевой пептид.

3. После встряхивания реакционной смеси с бензальдегидом эмульсию можно поместить в капилляр, запаять его и центрифугировать при низких скоростях. При этом коричневая бензальдегид-ная фаза и почти бесцветная водная фаза разделяются с четкой границей. Капилляр надламывают по этой границе и отбирают водную фазу для анализа сразу или после предварительного концентрирования.

4. Динитрофенилированием или дансилированием водной фазы после встряхивания с бензальдегидом можно определить С-конце-вую аминокислоту в виде соответствующего ДНФ- или ДНС-произ-водного. Этот метод особенно удобен для белков, когда концентрация свободных аминокислот в водной фазе весьма мала.

5. Реакция гидразинолиза возможна и в количественном варианте. Правда, в ходе реакции часто могут возникать артефакты, а выход реакции, за некоторыми исключениями, равен 85%. Поэтому, если в результате получают С-концевой остаток в количестве, меньшем 0,5 эквивалента, следует применить другой аналитический метод для того, чтобы решить, является ли обнаруженная аминокислота действительно С-концевой или же это артефакт.

И. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ

Карбокснпептидаза является экзопептидазой, которая расщепляет пептидные связи, соседние с концевыми СООН-группами. Место ферментативного гидролиза показано на следующей схеме:

Ri R2 R3

I [ I Карбокснпептидаза

.. •—NH—CH—CO—NH—CH—CO—NH—CH—COOH ^

Ri R2 R3

^ ... —NH—CH—CO—NH—CH—COOH + H2N—CH—COOH

Известны два типа карбоксипептидаз: А и В. Первая из них (А) неспособна отщеплять С-концевые основные аминокислоты, тогда как вторая (В) активна и в этих случаях.

Исследуемый белок инкубируют в присутствии карбоксипеп-тидазы при соответствующих условиях. В ходе инкубации из смеси отбирают пробы, в которых определяют свободные аминокислоты и таким образом устанавливают С-концевую последовательность изучаемого белка или пептида.

МЕТОДИКА

1, Предварительная обработка карбоксипептидазы. Кристаллический фермент суспендируют в небольшом количестве дистиллированной воды и добавляют один объем 1%-ного NaHCOs. Смесь центрифугируют на холоду и вновь суспендируют на этот раз в 1%-ном NaHC03. После этого фермент растворяют, медленно добавляя 0,4-н. NaOH, а затем доводят рН до 8 0,1 н. НС1 и добавляют к раствору большой избыток (примерно 50-кратный) 0,1 М ДИПФФ, разведенного в изопропаноле. Смесь оставляют стоять при комнатной температуре 90 мин.

2. Расщепление карбоксипептидазой. рН 0,5%-ного раствора исследуемого белка доводят до 8 в автотитраторе 0,01 н. NaOH под струей азота. Затем добавляют Ут часть ДИПФФ-обработанной карбоксипептидазы. Гидролиз длится 2—16 ч с отбором проб через каждые 60 мин. Пробы, содержащие по 0,2—0,3 мкмоля субстрата, депротеинизируют 1 объемом 10%-ной три хлор уксусной кислоты, осадок удаляют фильтрованием и фильтрат пропускают через колонку амберлита IR-4B в ацетатной форме (0,5 х 5 см) для удаления трихлоруксусной кислоты. После этого раствор упаривают в вакууме, остаток растворяют в нескольких каплях дистиллированной воды и хроматографируют в системе бутанол — вода или исследуют на аминокислотном анализаторе.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Ход реакции гидролиза, катализируемого карбоксипептидазой, в большой степени зависит от свойств субстрата. Нативность белков может препятствовать гидролизу, поэтому при получении отрицательных результатов следует повторить анализ на денатурированном субстрате. - I

2. Если белок состоит из нескольких неидентичных полипептид-" яых цепей, как в случае гемоглобина, то данный метод непригоден^ для определения С-концевой последовательности. Гидролити^ ческие продукты двух (или более) различных полипептидных цепей: при этом дадут весьма сложную смесь. j

3. Боковые группы С- концевой аминокислоты заметно влияют) на скорость реакции. Ароматические аминокислоты отщепляются! довольно быстро, тогда как гидролиз аминокислот с небольшой ней-f тральной боковой группой идет очень медленно. Чистые препараты карбоксипептидазы А не способны отщеплять основные С-концевые. аминокислоты (Лиз, Apr и Гис); эти остатки могут быть отщепле-; ны карбоксипептидазой В, которая была выделена совсем недавно^ Обычно имеющиеся в продаже препараты активны в отношениЩ основных аминокислот, так как представляют собой смесь двух] ферментов.

4. Как в белках, так и в пептидах имеются «устойчивые» пептидные связи, например связи в пролилпептидах не расщепляются кар-боксипептидазой.

5. Карбокснпептидаза не способна отщеплять С-концевые амиды (например, глицинамид).

6. Если препараты карбоксипептидазы содержат слишком много примеси эндопептидазы, то предварительная инкубация с ДИПФФ не исключает возможности гидролиза других пептидных связей. В таких случаях рекомендуется перекристаллизовать фермент.

страница 119
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Кникните, вся техника со скидкой в KNS по промокоду "Галактика" - мониторы для компьютеров цена - федеральный супермаркет компьютерной техники.
распродажи мебель для ванной в москве
Венчики KitchenAid купить
адаптер для светодиодов 12в. 1.5а купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.02.2017)