химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

веденным раствором NaOH доводят рН до 8. Затем к раствору добавляют мелко измельченный порошок сульфата аммония до 0,4 насыщения, после чего добавляют суперсель Хифло (Hyflo Supercel) и через 30 мин суспензию фильтруют через бумагу. Неактивный осадок отбрасывают, а к фильтрату добавляют сульфат аммония до 0,8 насыщения. После нового добавления суперселя Хифло осадок собирают на бюхнеровской воронке и суспендируют в 500 мл раствора сульфата аммония (0,5 насыщения). После перемешивания в течение нескольких минут суспензию центрифугируют, осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют сухой сульфат аммония до 0,7 насыщения. Суспензию оставляют стоять 30 мин, осадок отделяют центрифугированием, а супернатант диализуют против 0,005 М трис-HCl рН 8 для удаления сульфата аммония.

в) Фракционирование MgC72. После диализа раствор осторожно

нейтрализуют разведенной HCU стараясь не доводить рН ниже 7, поскольку фермент очень лабилен в слабокислой среде. К раствору

добавляют MgCl2 ДО концентрации 0,01 М и оставляют стоять на

холоду 2 ч. Суспензию центрифугируют, рН надосадочной жидкости доводят до 8 и добавляют к нему равный объем 0,05 М

трис-HCl рН 8.

г) Тепловая денатурация. Полученный таким образом растворбыстро нагревают до 70°С в водяной бане при температуре 85°С

и через 4 мин охлаждают до 20°С в ледяной бане. Неактивный,

осадок удаляют фильтрованием.

д) Фракционирование ацетоном. Фильтрат после нагревания

нейтрализуют разбавленной НС1 и охлаждают до 0° С. Затем добавляют охлажденный до—60°С сухим льдом ацетон до конечной концентрации 25%. Температура раствора при этом не должна подниматься выше —4°С. Осадок центрифугируют на холоду, растворяют

в небольшом объеме 0,005 М трис-HCl рН 8 и диализуют против

того же буферного раствора.

е) Далее фермент очищают электрофорезом на бумаге или в

крахмальном геле.

2. Определение ферментативной активности. Методика. Перед определением фермент активируют в смеси, содержащей 0,2 мл 0,025 М МпС12, 0,5 мл триса и 1 мл исследуемого раствора ЛАП (конечный объем 2,5 мл). Смесь инкубируют при 40°С 30 мин. В другой пробирке смешивают 0,2 мл 0,025 М МпС12, 0,5 мл триса, 1 мл 0,125 М L-лейцинамида и 0,55 мл воды. К этому раствору добавляют 0,25 мл раствора активированного фермента, а затем через определенные интервалы времени начиная с 0 мин отбирают аликвоты по 0,2 мл и титруют. При титровании в каждую пробирку вносят 3 капли тимолфталеина. Как только появляется голубая окраска, добавляют 1,8 мл этанола и титруют до появления постоянной синей окраски.

Расчет. Для того чтобы определить удельную активность фермента, сначала рассчитывают константу к± реакции по формуле

1 100

ft, = — lg I

1 t ё 100—н

где t — время в минутах, Н — процент гидролиза, рассчитанный из уравнения

(У,-Го) . 100

где Vt — количество щелочи, израсходованное за время t\ V0 —-количество щелочи, израсходованное при t — 0; Vs — количество щелочи, израсходованное на 1 мл бииодата. Удельную активность

выражают в виде протеолитического коэффициента С1 = —К где

Е — концентрация фермента в мг/мл. После фракционирования ацетоном величина Сг равна примерно 25 — 55.

3. Деградация белка, а) ЛАП активируют, как описано выше, б) К активированному ферменту добавляют примерно 50-кратный избыток диизопропилфторфосфата (ДИПФФ), растворенного в 0,1 М изопропаноле, и белок-субстрат, растворенный в 0,05 М трис-HCl рН 8, до конечной концентрации 1 %.

в) Через соответствующие интервалы (0,30, 60, 120 мин и т. д.) отбирают аликвоты и депротеинизируют их добавлением 10 объемов ацетона. Надосадочную жидкость концентрируют и идентифицируют хроматографией в бутанольной системе.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦОВ ГИДРАЗИНОЛИЗОМ

Белки и пептиды при нагревании с безводным гидразином подвергаются гидразинолизу. При такой обработке расщепляются все пептидные связи, и все аминокислоты, составлявшие пептидную цепь, превращаются в гидразиды, за исключением С-концевой, присутствующей в реакционной смеси в виде свободной аминокислоты [13].

[МЕТОДИКА

Обезвоживание гидразина. 100 г гидразинсульфата и 130 г NaOH смешивают в колбе и смесь перегоняют на масляной бане. Фракцию, полученную при 115°С и содержащую безводный гидразин, еще раз перегоняют над твердым NaOH.

2. Гидразинолиз пептидов. К высушенному пептиду добавляют несколько капель безводного гидразина, запаивают в толстостенной ампуле и инкубируют 6—16 ч при 115°С По окончании инкубации пробу быстро упаривают в вакуумном эксикаторе над кон-; центрированной H2S04. Остаток растворяют в нескольких каплях дистиллированной воды и смешивают с равным объемом бензаль-дегида. Образуется густая эмульсия, которую можно разделить на фракции лишь центрифугированием. Бензальдегидную фазу удаляют с помощью тонкого капилляра, а водную фазу упаривают. Остаток растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и хроматографируют в бутанольной системе.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Асп и Глу в ходе реакции почти полностью разрушаются; Apr теряет гуанидинову

страница 118
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить ручку скоба для пластиковой двери
гостиницы полярная звезда в якутске
театр гоголь центр афиша
транспортная компания корпоративным клиентам

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(16.12.2017)