химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

ой температуре добавляют 0,5 мл ФТЦ; при этом следят за тем, чтобы рН смеси оставался постоянным.

После образования ФТК-белка (около 2 ч) смесь экстрагируют сначала циклогексаном, затем бензолом и в заключение высушивают. Сухой препарат, освобожденный от бензола, растворяют в 3 мл раствора гуанидинхлорида (1 г/мл) и экстрагируют эфиром не^ сколько раз до тех пор, пока экстинкция экстракта при 270 нм не станет практически равна нулю. Затем к раствору белка в гуа-нидинхлориде добавляют 1 мл 6 н. НС1 и за процессом циклизации наблюдают в спектрофотометре. ФТГ-производное экстрагируют эфиром, свободным от перекисей (лучше всего это делать в аппарате Сокслета).

Эфирный экстракт содержит ФТГ-производное N-концевой аминокислоты. Пептид, находящийся в водной фазе с гуанидин-хлоридом после добавления диоксана и ФТЦ может быть снова подвергнут деградации.

ПРИМЕЧАНИЯ

Недостаток реакции деградации с ФТЦ заключается в том, что её продукт — ФТК-производное—плохо растворим в воде. Применение гуанидинхлорида лишь частично снимает это затруднение — в данных условиях выход все равно невелик, что может быть причиной плохой воспроизводимости. Для преодоления этих трудностей были предложены две модификации метода: с использованием полосок фильтровальной бумаги [6] или с использованием целлюлозного порошка [3]. Однако ни одна из них существенно не улучшает метода.

Д. АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТ В ПЕПТИДАХ МЕТОДОМ ЭДМАНА В ДАНСИЛЬНОМ

ВАРИАНТЕ [7—9]

После удаления N-концевой аминокислоты пептида, анализируемого по методу Эдмана, N-конец оставшейся полипептидной цепи можно определить дансильным методом. На следующем этапе отщепляют новую концевую аминокислоту и снова определяют N-конец остатка. Благодаря очень высокой чувствительности дан-сильного метода при наличии 0,1 мкмоля пептида можно с достаточной достоверностью идентифицировать 10—15 аминокислот.

Раствор, содержащий необходимое для анализа количество пептида, наливают в ампулу со шлифом и высушивают. Затем материал растворяют в 0,15 мл воды и добавляют 0,15 мл пиридина, содержащего 5% ФТЦ. Через гетерогенную реакционную смесь пропускают струю азота, затем ампулу запаивают и помещают в термостат на 60 мин при 40° С. После инкубации смесь высушивают в предварительно нагретом до 60°С вакуумном эксикаторе над NaOH и Р205, помещая эксикатор после откачивания воздуха в термостат при 60°С. После высушивания к остатку добавляют 0,2 мл безводной трифторуксусной кислоты и помещают пробирку на 30 мин в термостат при 45°С Затем смесь высушивают в вакууме, сухой остаток суспендируют в 0,2 мл дистиллированной воды (образуется мутная суспензия) и экстрагируют бутилацетатом 3 раза по 1,5 мл. Водную фазу высушивают в предварительно нагретом эксикаторе, и сухой остаток вновь растворяют в 0,15 мл воды. Раствор содержит укороченный пептид; из него отбирают пробу для анализа концевой аминокислоты и после этого определения вновь проводят деградацию.

Точно придерживаясь рекомендуемой продолжительности обработки и используя предварительно нагретый эксикатор, можно закончить одну ступень деградации, включая определение концевой группы, за один рабочий день.

При работе методом Эдмана очень важно тщательно высушивать препарат, а также полностью удалять трифтор уксусную кислоту, поскольку следы кислоты мешают нейтрализовать раствор и обеспечить оптимальную величину рН. Это ведет к мгновенному гидролизу ДНС-С1, который не успевает прореагировать ca-NH2-rpyn-пами. Если после гидролиза выявляется лишь ДНС-ОН, то данси-лирование следует повторить, особенно внимательно контролируя рН. На закисление среды указывает выделение пузырьков газа; если оно происходит, следует сразу же проверить рН и в случае необходимости нейтрализовать раствор, добавив бикарбонат.

Применяя дансил-эдмановскую методику, нужно соблюдать особые предосторожности при исследовании пептидов, в которых два остатка Асп следуют друг за другом. Поскольку Асп не всегда отщепляется количественно, можно ошибочно идентифицировать последовательность Асп-Асп. Иногда Гли освобождается вместе с предшествующим аминокислотным остатком, и это может привести к тому, что Гли останется незамеченным в ходе анализа.

Е. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТ В ПЕПТИДАХ ДЕГРАДАЦИЕЙ ПО ЭДМАНУ И КОЛИЧЕСТВЕННЫМ АМИНОКИСЛОТНЫМ АНАЛИЗОМ

При ступенчатой деградации пептидов для расшифровки последовательности достаточно определить аминокислотный состав пептида, остающегося после каждого очередного отщепления. Предположим, пептид имеет состав А, В, С, D, Е. Если мы после каждой ступени ФТЦ-деградации проведем определение состава укороченного пептида, то получим следующие результаты:

после деградации I: А, С, D, Е; после деградации II: A, D, Е; после деградации III: D, Е; после деградации IV: Е;

потерян остаток В;

потерян остаток С;

потерян остаток А;

потерян остаток D

Из полученных данных очевидно, что пептид имеет последовательность B-C-A-D-E.

Однако этот метод целесообразно использовать лишь тогда, когда

страница 116
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить плитку monopole ceramica bonjour crema
продажа земельных участков в московской области в расрочку
ландшафтный дизайн курсы москва лучшие
стеллажи дешево

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)