химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

от (е-Жг-ДНФ-Лиз, 0§ ДНФ-Тир) обычно являются производными не концевых амино| кислот, а остатков, расположенных внутри цепи! Таким образом^ количественно определяя и идентифицируя а-ДНФ-аминокислоты^ мы получаем данные относительно N-кбнцевых аминокислот, которые позволяют рассчитать число пептидных цепей у изучаемого белка.

ДНФБ — высокореакционноспособное соединение, количественно реагирующее с белками в мягких условиях без побочногр расщепления пептидных связей. Поэтому можно не опасаться, что в ходе анализа в результате расщепления пептидных связей появятся «новые» концевые группы.

ДНФ-производные, за исключением некоторых, образующихся при реакции с остатками, расположенными внутри цепи, имеют желтую окраску, что облегчает их идентификацию и определение. Это чувствительные к свету соединения, поэтому эксперименты должны проводиться в темноте или по крайней мере следует избегать дневного освещения и использовать искусственное.

Анализ состоит из следующих стадий: 1) динитрофенилирование, 2) удаление избытка реагента, 3) гидролиз ДНФ-производного, 4) растворение ДНФ-аминокислот.

1. ДИНИТРОФЕНИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ,

Белок обрабатывается ДНФБ в ^слабощелочной среде, при комнатной температуре.

МЕТОДИКА

1 г белка растворяют или) суспендируют в 10 мл 10%-ного раствора NaHC03 и добавляют 2 объема 5%-ного раствора ДНФБ в этаноле. Реакционную смесь встряхивают в темноте при комнатной температуре в течение 4—72 ч. Продолжительность инкубации зависит от растворимости и реакционноспособности исследуемого белка. Если реакция идет в гетерогенной фазе, т. е. динитрофенили-руют малорастворимое вещество, то лучше увеличить время инкубации и сравнить результаты, получаемые при динитрофенилирова-нии в течение 24, 48 и 72 ч. Однако если реакция идет в гомогенной фазе, т. е. динитрофенилируют растворимый в бикарбонате белок или белок не выпадает в осадок после добавления спиртового раствора ДНФБ (или образуется лишь небольшой осадок), то реакция заканчивается за 2—4 ч. По окончании реакции раствор или суспензию подкисляют несколькими каплями 0,6 н. НС1. Осадок отделяют центрифугированием и промывают сначала смесью этанол— эфир (1 ; 1) и затем эфиром. ДНФ-белок хранят в темном месте в вакуумном эксикаторе.

2. ГИДРОЛИЗ ДНФ-БЕЛКА ИЛИ ДНФ-ПЕПТИДА И ЭКСТРАКЦИЯ

ДНФ-ПРОИЗВОДНЫХ

ДНФ-производное гидролизуют кислотой. Обычно в условиях эксперимента большая часть ДНФ-аминокислот не разрушается и их можно экстрагировать органическими растворителями в соответствии с растворимостью.

МЕТОДИКА

ДНФ-производное гидролизуют в 80-кратном избытке 6 н. НС1 при 100° С 16 ч в ампуле, запаянной под вакуумом или в атмосфере азота. Гидролизат разбавляют в 3 раза дистиллированной водой и трижды экстрагируют свободным от перекиси эфиром. Эфирные фракции собирают и встряхивают 2—3 раза с дистиллированной водой для удаления следов кислоты, обезвоживают добавлением сухого Na2S04, упаривают, а затем растворяют в нескольких каплях метанола и в 5—10 мл воды. Водную фазу освобождают от кислоты в вакууме и снова упаривают. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока полностью не удалят НС1. В заключение остаток растворяют в небольшом объеме воды.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. В описанных условиях ДНФ-Про разрушается полностью, а ДНФ-Гли — на 60—70%. ДНФ-Про еще можно определить, если вести гидролиз в 12 н. НС1 в течение 4 ч. Для определения ДНФ-Гли гидролиз следует проводить в течение 3—4 ч в 6 н. НС1 или же в смеси хлорной и уксусной кислот.

2. Описанная выше методика рекомендуется и для гидролиза ДНФ-пептидов.

3. Если в ходе анализа получается отрицательный результат, т. е. концевые группы обнаружить не удается, должны быть рассмотрены следующие возможные причины этого: 1) исследуемое вещество представляет собой циклическую молекулу и не имеет свободной а-гШ2-группы; 2) молекула имеет малореакционно-способный (заблокированный) N-конец; 3) концевая группа ацети-лирована (как, например, в цитохроме с или в белке вируса табачной мозаики); 4) и наконец, возможно, что ДНФ-производное (ДНФ-Про, ДНФ-Гли) разрушилось в ходе определения. Необходимо также учитывать, что выход ДНФ-Вал и ДНФ-Иле невелик из-за устойчивости к гидролизу пептидных связей Вал-Х и Иле-Х; в таких случаях следует проводить гидролиз в течение 72 ч.

4. Если концевым остатком является бис-ДНФ-Гис, то более удобно экстрагировать гидролизат этилацетатом, так как бис-ДНФ-Гис плохо растворим в эфире..

5. В эфире растворимы почти все концевые ДНФ-производные, а е-гШ2-ДНФ-Лиз, N-ДНФ-Гис, ДНФ-цистеиновая кислота (концевая) исс-ДНФ-Арг (концевой) растворяются также в воде.

3, ХРОМАТОГРАФИЯ ДНФ-АМИНОКИСЛОТ НА БУМАГЕ

ДНФ-аминокислоты идентифицируют с помощью одно- или двумерной хроматографии на бумаге и определяют их количество соответствующими методами [11].

МЕТОДИКА

Л. Метод Леей с истльзовцншм толуола. Очистка толуола. Перегнанный толуол 24 ч перемешивают с серной кислотой (1 : 1). Органическую фазу декантируют и отгоняют над А1С13. Перегнанный толуол встряхивают несколько раз с 20%-ны

страница 109
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
пассажирское такси микроавтобус
металлические полки стеллажи
купить билеты на новогоднюю елку на братьев запашных
офисное кресло купить в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.09.2017)