химический каталог




Аминокислоты, пептиды и белки

Автор Т.Дэвени, Я.Гергей

пластинку. Тщательно вымытую хроматографиче-скую камеру заполняют буферным раствором до высоты 1 см, закрывают ее и помещают в воздушный термостат (45°С) на 15 мин. Нижний край пластинки погружают в подогретый буферный растГлу

вор и проводят хроматографию, позволяя ему подниматься до высоты 18 см (около 3,5 ч). После высушивания хроматограмму проявляют коллидин-нингидриновым реагентом. Фракционирование очень чувствительно к колебаниям рН и температуры. Повышение рН на 0,1—0,2 единицы влечет за собой резкое увеличение Rp что может улучшить разделение в нижней части хроматограммы — где мигрируют основные и ароматические аминокислоты (Лей, Иле, Мет и Вал), однако, разделение в верхней части хроматограммы — где мигрируют аминокислоты от Ала до Асп, ухудшается.

Одномерная тонкослойная ионообменная хроматограмма дает почти те же значения Rf аминокислот, что и диаграмма, полученная на аминокислотном анализаторе. Разделение аминокислот от Асп до Ала в анализаторе также чувствительно к изменению рН и молярности буферного раствора и ухудшается при увеличении рН. В то же время разделение аминокислот от Вал и далее уже нечувствительно к изменению рН и молярности.

Следовательно, если, например при хроматографии в тонком слое, основные и нейтральные аминокислоты до Вал имеют необычно высокие значения Rj и вместе с тем разделение в верхней части пластинки оказалось неполным, можно сделать вывод, что рН буферного раствора выше 3,3. К сожалению, большинство приборов для измерения рН недостаточно надежны и точны, поэтому приходится поступать так, как это принято при фракционировании в анализаторе, где рН буферного раствора проверяют по шесту цистина». В тонкослойной хроматографии рН также проверяют по относительной подвижности компонентов. В оптимальном варианте цистин располагается между Ала и Вал.

Если значение Rf Вал близко к 0,5, а Асп — к 0,9, но последняя еще не уходит с фронтом растворителя, то рН буфера оптимален. Колебания температуры в первую очередь отражаются на разделении Мет, Иле и Лей. При 45—50QC разделение этих трех аминокислот удовлетворительно и вполне воспроизводимо. При понижении температуры разделение ухудшается, а при температуре ниже 40°С аминокислоты вообще не разделяются. По-видимому, температура 45°С является оптимальной, так как, с одной стороны, достигается полное разделение этих трех аминокислот, а с другой ?— при такой температуре еще нет необходимости в добавлении специальных веществ (например, глицерина), уменьшающих испарение буфера, которые могут влиять на разделение в верхней части хроматограммы.

Следует подчеркнуть, что ионообменная хроматография в тонком слое не годится для количественного определения аминокислотного состава белковых гидролизатов, так как она дает только качественную картину. Зато этот метод вполне применим для исследования гидролизатов пептидов и пептидных остатков при расшифровке последовательности аминокислот. Он позволяет определить молярные пропорции обнаруженных аминокислот — обычно по отношению к какой-либо данной аминокислоте. Если, например, исследуют трипсиновый гидролизат, то таким эталоном для сравнения служит Лиз или Apr. Как правило, оценку производят визуально или на денситометре. Этим методом можно определить соотношение компонентов в пределах 4—5-кратных различий (например, молярные соотношения в пептиде Лиз ^алгГлугТрез). При меньших различиях относительных молярных концентраций аминокислот метод теряет чувствительность. Это не позволяет его использовать для анализа белков, в которых эти различия могут быть очень малы (например, Лиз 1оАспб5Вал48Глу49 ... и т.д.).

ИОНООБМЕННАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ [И, 12]

Ферментативный гидролиз можно проводить различными способами, один из которых состоит в следующем: в пластмассовой пластинке толщиной 10—15 мм, длиной 10 см и шириной 5 см высверливается 2 ряда углублений. Объем всех, кроме одного, углублений должен быть примерно 50 мкл, а объем крайнего верхнего — в 3 раза больше. Это углубление выполняет роль реакционного сосуда; обозначим его через Р, а все остальные цифрами 1, 2, З...п. Исследуемый пептид (около 0,05 мкмоль) в 0,1 М бикарбонате аммония вносят пипеткой в углубление Р. Во все остальные углубления наливают по 10 мкл 1 н. НС1. После этого в углубление Р добавляют соответствующий фермент (например, карбоксипептидазу А, кар-бо кс и пептид аз у В или их смесь, а в случае N-концевого анализа — аминопептидазу). Количество фермента составляет 1/20 часть количества пептида. Сразу после добавления фермента 10 мкл смеси из «реакционного сосуда» переносят в углубление /, где уже находится HQ.

^ Пластинку покрывают парафильмом (или стеклянной пластинкой) и ставят в воздушный термостат при 37°С. Через определенные промежутки времени (целесообразно через 30, 60, 90, 120 мин) отбирают пробы из углубления Р и переносят в углубления 2, 3, 4... ит. д. Таким образом можно проследить за кинетикой гидролиза, происходящего в углублении Р. По окончании реакции содержимое углу

страница 105
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148

Скачать книгу "Аминокислоты, пептиды и белки" (2.92Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
plexa lm 1.pk10 стар. бел.люстра
антибактериальная обработка кондиционера автомобиля
сковорода-вок
пригласительный билет на 05.11.2016 spacemoscow

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)