химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

о \) лизина приобретали отрицательный заряд. Могут быть использованы также ангидриды других дикарбоновых кислот, однако реакция с ними обратима. Такой способ модификации субъединиц может привести к диссоциации олигомера из-за электростатического отталкивания одинаково заряженных группировок. Проблему диссоциации можно решить путем частичного ацилирования янтарным ангидридом, однако при этом возникает задача получения гомогенных препаратов. Метод гибридизации не дает результатов, если до и после модификации белок имеет разную четвертичную структуру или его вообще не удается реконструировать после диссоциации на мономеры.

1.4,3.1. Методики. Далее в качестве примера приводятся две различные методики сборки гибридных белков из гомологов и химически модифицированных субъединиц.

Гибридизация гемоглобина [178]. Смесь гемоглобина S и радиоактивно меченного гемоглобина А (1:1) с целью диссоциации на а- и р-цепи диализу ют при 3 °С в течение 48 ч против 0,1 М натрийацетатного буфера (рН 5). Сборку проводят путем повторного диализа против дистиллированной воды в течение 24 ч. Хроматографическим путем получают радиоактивно меченный гемоглобин S — гибридный белок, образованный в результате обмена ое-це-пями гемоглобина А и S.

Гибридизация альдолазы [120], Смешивают в различных мольных соотношениях нативную и ацилированную (янтарным ангидридом) альдолазу (концентрация белка 0,4%) в 0,02 М калийфосфатном буфере (рН 6,5), содержащем 4,0 М мочевину, 0,002 М ЭДТА и 0,1 М дитиотреит при 4 °С. Спустя 30 мин образцы диализуют в течение 12 ч для удаления мочевины против буфера, содержащего 0,5 М NaCl, 0,2 мМ дитиотреит, затем 2—3 раза против буфера, не содержащего NaCl.

1.4.4. Диссоциация и сборка

Третичная и четвертичная структуры олигомеров нарушаются в присутствии мочевины, гуанидингидрохлорида и ДНС (разд. 1.3) ив результате химической модификации (разд. 1.4.3).

1.4. СООТНОШЕНИЕ МОНОМЕРОВ В ОЛИГОМЕРЕ

59

Идентифицируя продукты диссоциации, можно определить соотношение мономеров в олигомере. Существенное значение может иметь рН среды. Например, агглютинин проростков пшеницы и его сукцинилпроизводное при рН>5— димеры, но диссоциируют при рН<5 [122]. Зависимость четвертичной структуры от рН определяет условия сборки и реконструкции белка. Гемоцианин, агрегат из 8 гексамеров, диссоциирует на мономеры и димеры при рН 8,9 (в присутствии ЭДТА для связывания Са2+). Напротив, при изменении ионной силы, рН и концентрации Са2+ гемоцианин диссоциирует с образованием комплексов гексамера промежуточного размера [20].

Дополнительные возможности метода, основанного на химической модификации, рассмотрены в работе [184] на примере мультиферментного комплекса дрожжевой синтетазы жирных кислот. При этом вместо янтарного ангидрида, который необратимо ацилирует остатки лизина, предложено использовать ангидриды других дикарбоновых кислот, цитраконовый или лучше диметилмалеиновый ангидрид. В отличие от цитракони-ламидов диметилмалеилмоноамиды могут легко гидролизовать-ся в мягких условиях. После ацилирования диметилмалеиновым ангидридом а- и ^-полипептидные цепи диссоциируют при повышении рН или снижении ионной силы. Реакция ацилирования обратима в слабокислой среде (рН 4,6), что допускает последующую сборку олигомера. Именно потому, что нативная конформация мономерных ферментов относительно легко реконструируется (разд. 1.5.1.3), по-видимому, как термодинамически

С^3 /Р О СН3

NH> + I С> hNH~C-C=C-COOH

/С CV СНз

СН3 О

наиболее выгодная, можно показать, что олигомерные ферменты сохраняют специфичность in vitro после обратимой денатурации и последующей реконструкции [39].

Для отдельных олигомеров существенное значение могут иметь параметры среды, например величина рН. После диссоциации фумаразы в мочевине [186] и диализа против воды не происходит сборки активного тетрамера, однако реконструкция удается при диализе против буфера в отсутствие мочевины (разд. 1.4.4.1). Первоначально образующийся продукт обладает частичной активностью и является в основном димером, хотя данные флуоресценции и кругового дихроизма совпадают с соответствующими параметрами нативного тетрамера.

60

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

1.4.4.1. Методики. Ниже приводятся методики диссоциации и реконструкции конкретных ферментов с использованием денатурирующих агентов (пример 1) и химической модификации (пример 2).

Пример 1 [186J. Фумаразу из сердца свиньи (0,5—5 мкг/мл) пнактиви-руют при 25 °С в течение 30 мин в присутствии 6 М мочевины (или гуанидин-HCl) в растворе следующего состава: 50 мМ фосфатный буфер (рН 7,3)+6 М мочевина (или гуанидин-НС1) + 10 мМ дитиотреит+0,1* мМ ЭДТА+10 %-ный глицерин+200 мМ КС1.

Затем раствор диализуют против исходного буфера, но не содержащего мочевину, при 4 °С в течение 24 ч, а затем инкубируют при 25 °С в течение 3 ч.

Пример 2 [184]. К раствору синтетазы жирных кислот (5—6 мг/мл) в 0,3 М калийфосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 10 мМ 2-меркапто-этанол, прибавляют 13 мкл свежеприготовленного 0,8 М раствора диметил-малеинового ангидрида в сухом тетрагидрофуране. Смесь инкубируют при 0 °С в течение 30 мин, а затем диализуют против 100 мМ трис-HCl буфера (рН 8,0), содержащего 1 мМ дитиотреит. Для обессоливания используют гель-фильтрацию на сефадексе G=50.

Реактивация фермента. Прежде всего с помощью гидролиза в мягких условиях снимают ацильные группы модифицированных аминокислот. Раствор белка разбавляют вдвое 0,2 М трис-ацетатным буфером (рН 8,1). При содержании белка <1 мг/мл в раствор добавляют бычий сывороточный альбумин до суммарной концентрации белка 1 мг/мл. Раствор осторожно титруют при комнатной температуре насыщенным (при 23 °С, 100%-ное насыщение) сульфатом аммония, подкисленным до рН 2 концентрированной серной кислотой. Белок начинает выпадать в осадок при рН ~6,5. Суспензию выдерживают при рН 4,6 и комнатной температуре в течение 30—60 мин, а затем центрифугируют при 28 000 g и 4 °С в течение 30 мин. Осадок ресуспендируют в охлажденном до 4 °С буфере следующего состава: 100 мМ калийфосфат (рН 8,5)+ 10 мМ дитиотреит+0,5 мМ калий ЭДТА+10 мкМ флавинмононуклеотид. Небольшая примесь бычьего сывороточного альбумина (0,1 мг/мл) способствует растворению осадка. Сульфат аммония удаляют с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-50 в указанном буфере. Обессоленный образец (1—2 мг/мл) инкубируют в буфере для реактивации при 25 °С.

1.4.5. Электрофорез в полиакриламидном геле

Если олигомер включает два и более различных типов мономеров (или полипептидных цепей), которые могут быть разделены электрофорезом в ПААГ, то стехиометрическое содержание субъединиц можно определить денситометрией или с помощью введения радиоактивной метки. Предварительно субъединицы выделяют в очищенном состоянии и определяют в молекуле содержание остатков меченых аминокислот; в случае денситометрии строят градуировочные графики связывания красителя.

1.4.5.1. Введение радиоактивной метки. Каждая субъединица исследуемого белка должна содержать по крайней мере один аминокислотный остаток, по которому можно ввести радиоактивную метку. С целью повышения чувствительности рекомендуется вводить метку по нескольким точкам. Введение метки

1.4. СООТНОШЕНИЕ МОНОМЕРОВ В ОЛИГОМЕРЕ

61

проводят в жестких денатурирующих условиях, когда все аминокислотные остатки включают метку в равной степени. Более того, реакция модификации должна быть специфичной и проходить с предельной полнотой. При этом важно, чтобы аминокислотные остатки сохранили заряд. Если же заряд изменился, то необходимо специально исследовать возможность отделения модифицированных немеченых субъединиц с помощью электрофореза.

Большинство белков содержат достаточно много остатков лизина, которые могут быть специфически помечены путем образования амидинов без изменения заряда. Условия проведения реакции выбирают такими, чтобы N-концевые аминокислотные остатки не затрагивались. Другим возможным объектом модификации могут служить остатки цистеина. Соответствующие реакции рассматриваются в разд. 1.5.1. Наибольший интерес из них представляет алкилирование иодоуксусной кислотой или иодоацстамидом. В случае иодоуксусной кислоты белок приобретает дополнительный отрицательный заряд. С целью введения метки можно восстановить дисульфидные связи, а затем провести алкилирование. Если мономер включает полипептид-иые цепи, связанные дисульфидными связями, этот метод неприменим. С помощью введения метки можно определять внутри- и межцепочечпые дисульфидные связи, проводя модификацию в обычных и денатурирующих условиях. Межцепочечпые связи сывороточной холинэстеразы человека были восстановлены и алкилированы в отсутствие денатурирующих агентов [106].

Если предположить, что модификация различных мономеров проходит одинаково, то радиоактивность D{ (расп./мин) мономера i пропорциональна молярному содержанию Х{ мономера и содержанию Li потенциально модифицированных групп в 1 моле мономера I:

Diocli-Xi

Для определения устанавливают аминокислотный состав и. молекулярную массу очищенных мономеров. Для любых двух мономеров i и / справедливо

Xj LrD}

Введение радиоактивной метки. Методика алкилирования остатков цистеина иодоуксусной кислотой описана в разд. 2.2.1.1. Меченая [14С]иодо-уксусная кислота может быть разбавлена немеченым реагентом.

Известен метод пептидных карт, включающий операции амидинирования белка метнл[14С]иминоацетатом, электрофорез в тонком слое, хроматографию-и авторадиографию [17].

Амидинирования белков. [16]. Образцы белка (до 1 мг) диализуют против 1 мМ ЭДТА (рН 7,0) и высушивают лнофильно. Сухой остаток раство-

?2

I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

ряют в 0,1 мл 0,2 М натрийборатного буфера (рП 8,5), содержащего 5 М гуанидин-HCl, 2 мМ ЭДТА и 0,01 %-ный (масс/об. )азид натрия; добавляют 0,01 мл 1 М раствора метил-1-[14С]иминоацетата (концентрация реагента в

+NH2 + NH,

ii ii :н3-с OCH, + NH2-R-*CH3-C NH -R + CH.OH

реакционной смеси 0,1 моль/л) и инкубируют при комнатной температуре и течение по крайней мере 5 ч. После включения метки образец разбавляют до необходимой концентрации и проводят электрофорез в ПААГ. Образец может быть диализован против электрофоретического буфера с целью удаления избытка радиоактивно меченных примесей.

Измерение радиоактивности [16]. По завершении электрофореза белковые зоны проявляют (окрашивают), вырезают, помещают в пластмассовые пробирки для измерения скорости счета и высушивают в вакууме. Высушенный гель выдерживают в 0,3 мл 30%-ного Н202, содержащего 1% NH4OH, при 60 "С в течение 6 ч до полного растворения. В контрольных опытах было показано, что при этом не происходит потери метки. Добавляют сцинтилля-тор 13,0 мл смеси толуол — тритон 2:1)], содержащий 2,5-днфенилоксазол (5 г/л), и измеряют скорость счета. В качестве внешнего стандарта используется тВа. Эффективность счета составляет обычно 70-—75%. Для определения фона используют кусочки геля без метки, обработанного аналогичным образом.

1.4.5.2. Денситометрия. Для обнаружения белков в геле часто используют краситель кумасси, однако при высоких концентрациях белка наблюдаются отклонения от закона Бэра. Зависимость оптической плотности от концентрации линейна при концентрациях белка 1—50 мкг; влияют тип белка, размеры геля и длина электрофоретического пробега зоны. Денситометрия окрашенных зон невозможна, если зоны сильно отличаются по содержанию белка. Способность связывать молекулы красителя сильно варьирует у различных белков. Полагают, что связывание красителя основано на электростатическом взаимодействии между 'молекулой красителя и основными группами белка (т. е. основные белки окрашиваются более интенсивно по сравнению с кислыми), однако, вполне возможно, имеет место и тидрофобное взаимодействие. Вследствие этого необходимо определять связывающую способность каждого исследуемого белка.

Методика. Электрофорез проводят в пластине геля; в лунки вносят пробы исследуемого белка (например, 1, 2, 40 мгк); исходную концентрацию белка определяют рефрактометрически, взвешиванием, спектрофотометрически или по данным аминокислотного анализа; гель окрашивают по методике, описанной в разд. 1.2.1.1. Каждый трек сканируют на денситометре при Ятах = 590—595 нм (Xmin = 400 нм). Площадь пика определяют с помощью интегратора или путем! взвешивания диаграммной бумаги, ограниченной кривой [61]. В области

1.3. СШИВАНИЕ ОЛИГОМЕРА И МОНОМЕРА

63-

сохранения закона Бера строят градуировочный график в координатах длина пробега зон — молекулярная масса белка. Окрашивание и обесцвечивание (разд. 1.2.1.2) гелей следует стандартизировать, в противном случае площадь пика на единицу массы белка сильно варьирует для каждого геля. Диссоциированный олигомер следует разделять в том же геле. По результатам анализа диссоциированного олигомера определяют соотношение мономеров по массе. По этому соотношению с учетом молекулярной массы мономеров рассчитывают молярный состав олигомера.

1.4.6. Аминокислотный анализ

Соотношение различных мономеров (или полипептидных цепей) в олигомере можно рассчитать по данным аминокислотного анализа. Этот метод особенно эффективен, если олигомер и мономеры имеют существенно различное содержание отдельных аминокислот [29, 185].

Для олигомера из двух субъединиц аир содержание любой из аминокислот рассчитывают по формуле:

Х = аХа + ЬХь

где X, Ха и А"р — содержание (в молярных процентах) аминокислоты в олигомере и субъединицах, а и Ь — коэффициенты, отражающие соотношение субъединиц аир, по массе. Для определения коэффициентов а и Ь используют метод регрессионного анализа.

1.5. Сшивание олигомера и мономера

О факте сшивания отдельных субъединиц свидетельствуют данные анализа N-коицевых аминокислотных остатков. Например, выход N-концевой аминокислоты в количестве >1 моль/ /моль белка может служить доказательством присутствия в олигомере двух идентичных полипептидных цепей. Аналогичным образом выход N-концевых аминокислот (исключая серии) на уровне 50% может служить признаком того, что N-концевая аминокислота одной из двух цепей блокирована. Поскольку выход N-концевой аминокислоты зависит от многих факторов, в истолковании полученных результатов следует избегать поспешных выводов.

В белках были найдены различные типы поперечных связей: дисульфидная, альдольная и альдиминная. Наиболее лабильные из них — S—S-связи, поэтому на практике чаще всего прибегают именно к расщеплению дисульфидных связей. Для разделения образующихся полипептидных цепей используют обычные методы, принятые при разделении мономеров (разд. 1.3.2).

64

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

1.5.1. Дисульфидные связи

Дисульфидные связи расщепляют путем окисления, восстановления, с помощью реакций нуклеофильного замещения (HS03~, CN-, ВН4~, Н~) ;[40, 106] (см. также гл. 2). При окислении S—S-связей образуются два остатка цистеиновой кислоты [160]. Дополнительные сульфогруппы придают молекуле белка заметную гидрофильность, повышая его растворимость в воде, в особенности в области низких рН. Однако окисление дисульфидных связей сопровождается модифи

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
какие машины входят в класс комфорт в такси максим
лампа gauss светодиодная рефлекторная е27 9w 4100к
светящаяся надпись для дома
корбина бурана

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.03.2017)