химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

арата с держателем образца). Верхняя часть рисунка иллюстрирует метод негативного контрастирования.

20.2.3. Электронный микроскоп

Электронный микроскоп аналогичен световому в том отношении, что в него входят линзы, формирующие изображение (рис. 20.12). Электроны излучаются горячей нитью катода электронной пушки и ускоряются за счет высокой разности электрических потенциалов между пушкой и остальной частью микроскопа. Поток таких электронов эквивалентен пучку монохроматического света, и поэтому все теоретические принципы, лежащие в основе световой микроскопии, применимы и к электронной. В большинстве современных микроскопов исследуемый образец помещается на тонкую угольную пленку, поддерживаемую медной сеточкой (рис. 20.13), Держатель образца сконструирован так, чтобы образец можно было легко перемещать внутри микроскопа, но в то же время чтобы не происходило его самопроизвольного смещения и не было вибраций при визуальном наблюдении и фотографировании.

Образец размещают внутри специального устройства — ан-тиконтаминациопной ловушки, охлаждаемой до температуры жидкого азота с помощью медного стержня, соединенного с резервуаром для охлаждающего агента. Благодаря низкой температуре на поверхности этого устройства конденсируются вещества, испаряющиеся из образца при его бомбардировке элек-

550

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

тронами, а также любые загрязнения, которые могут попасть в микроскоп. При взаимодействии электронного пучка с молекулами могут возникать химически активные свободные радикалы, реагирующие с веществом образца и подложки. В отсутствие низкотемпературной ловушки это приводит к образованию на образце слоя загрязнений, который снижает разрешение и часто приводит к артефактам.

Ниже образца размещена первая группа электромагнитных линз, функционально эквивалентная объективу оптического микроскопа. Еще ниже находятся проекционные линзы, проецирующие изображение на флюоресцентный экран для прямого наблюдения или фотопленку для получения микрофотографии.

Изменение фокусного расстояния проекционных линз приводит к изменению увеличения, создаваемого электронным микроскопом. Увеличение может достигать Х250 000, и обычно его можно поднять еще втрое при фотопечати без снижения разрешения деталей структуры на микрофотографиях. Фокусное расстояние проекционной системы регулируется током, протекающим через катушки магнитных наконечников линз. По этой причине электронные устройства, входящие в состав микроскопа, должны отвечать очень высоким требованиям, обеспечивающим возможность не только изменять ток, протекающий через линзы, по и жестко стабилизировать его на любом заданном уровне. В противном случае увеличение будет непрерывно меняться.

Фокусирование изображения достигается изменением тока, протекающего через объективную линзу, и это необходимо делать после каждого изменения увеличения. В ходе нормальной работы микроскоп просто переключают на требуемое увеличение (при этом его электронные системы сами устанавливают в соответствующих линзах требуемые токи), а затем фокусируют изображение, регулируя ток объективной линзы.

20.2.4. Технические проблемы

Поскольку изображения молекул возникают в результате их взаимодействия с электронами, можно ожидать, что присутствие любых посторонних атомов будет приводить к снижению качества изображения. Поэтому внутри колонны микроскопа создается вакуум. В этих условиях помещенный в микроскоп образец будет неизбежно подвергаться дегидратации. Ниже рассмотрены методы, позволяющие избежать изменений структуры исследуемых образцов при их дегидратации.

Другой нежелательный эффект возникает из-за взаимодействия электронов с самим образцом. Он обусловлен не только разрушающим действием электронов высоких энергий, но и воз-

20.2. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

551

никновением высокореакционноспособных химических радикалов, что приводит к загрязнению образца при его микроскопи-ровании. Влияние химических радикалов может быть снижено размещением вблизи образца медной диафрагмы, охлажденной до температуры жидкого азота, которая сорбирует на своей поверхности загрязняющие образец частицы. Разрушающее действие собственно электронов может быть уменьшено только снижением дозы облучения. Более подробно это рассмотрено в разделе, посвященном молекулярной микроскопии.

Влияние эффектов дегидратации, загрязнения и радиационного повреждения может быть уменьшено «окрашиванием» образцов солями тяжелых металлов. Такое окрашивание проводят перед высушиванием образца, и связавшийся с ним «краситель» значительно менее чувствителен к действию дегидратации и электронной бомбардировке, чем легкие атомы, образующие объект. Кроме того, соли тяжелых металлов обладают значительно большей электронной плотностью, что уменьшает влияние загрязнений на качество изображения. Однако и в этом случае необходимо добиваться максимальной чистоты внутренних элементов конструкции микроскопа и поддерживающих образец медных сеточек, а также применять различные технические средства, позволяющие уменьшить дозу облучения образца.

20.2.5. Подготовка образцов и их «окрашивание»

Для электронного микроскопирования биологические объекты обычно заключают в подходящий полимерный носитель и затем разрезают на тонкие слои с помощью стеклянного или алмазного ножа. При изучении макромолекул исследователь имеет дело с их раствором в подходящем буфере. Два фактора определяют выбор такого буфера: во-первых, летучесть в процессе высушивания и, во-вторых, инертность к «красителю». В практике чаще всего используют буфер, приготовленный на основе ацетата аммония. И хотя такой буфер летуч, не следует забывать, что в процессе высушивания образца он многократно концентрируется. Иногда такое концентрирование буфера приводит к изменению структуры или, например, агрегации молекул так, что их микроскопированне после «окрашивания» выявляет наличие искажений или разрушения исследуемого объекта.

В микроскопе образец помещают на тонкую ( — 15 нм) углеродную пленку. Такую пленку можно получить путем конденсации паров углерода на поверхности свежего скола слюды. Для изготовления пленки используют углеродные стержни диаметром 5 мм. Конец одного из стержней длиной 10 мм стачивают до диаметра 1,5 мм и заостряют. Заточенный кончик такого

552

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

тонкий (1,5 мм} угольный стержень

200 мм

слюда

угольная пленка

ПОВЕРХНОСТЬ

воды

РИС. 20.14. Испаряемый в вакууме углерод конденсируется на поверхности слюды, и образовавшуюся пленку можно снять на поверхность воды.

стержня приводят в контакт с плоским торцом второго стержня и испаряют, пропуская через область контакта электрический ток силой —30 А. Испарение происходит в самой тонкой части стержня, а постоянство контакта осуществляют поджатием одного из стержней с помощью пружины (рис. 20.14).

Испаряемый углерод конденсируется на поверхности слюды, расположенной на расстоянии —200 мм от источника испарения. Если поместить за слюдой листок белой бумаги, она также покроется слоем углерода с тенью от кусочка слюды. При наличии некоторых навыков контрастность «затененного» участка можно использовать в качестве удобного визуального критерия толщины углеродного слоя.

Углеродную пленку можно легко удалить с поверхности слюды, поскольку она чрезвычайно гидрофильна. Это делается мед-

20.2. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

553v

ленным погружением слюды в чистую воду под углом —45° относительно поверхности воды. Угольная пленка отделяется от слюды и всплывает на поверхность воды, где ее можно перемещать, например, с помощью тонкого волоска. Очень важно на всех этапах приготовления таких пленок соблюдать чистоту. Так, подрезание краев пластинки слюды надо выполнять тонкими ножницами, а расщеплять и держать ее следует только пинцетом. Чашка Петри для воды должна быть вымыта с применением детергента, который надо тщательно отмыть. После прокаливания в пламени ее заполняют водой, перегнанной в стеклянном дистилляторе. Такие предосторожности позволяют избежать загрязнений поверхности слюды и воды, которые могут мешать снятию пленки.

Такие тонкие пленки монтируют на мелкоячеистые (200 или 400 меш) медные сеточки диаметром 3 мм. Целесообразно поместить сразу несколько их десятков на подставку или проволочную сетку, расположенную ниже поверхности воды, еще до того, как снимать угольную пленку со слюды. В этом случае для того, чтобы смонтировать пленку, достаточно после ее снятия со слюды просто поднять подставку или понизить уровень воды. При аккуратном выполнении описанных выше процедур большая часть сеточек оказывается покрытой угольной пленкой по всей поверхности. Следует помнить, что сеточки и подставка должны быть предварительно обезжирены органическим растворителем или прокаливанием. Смонтированную угольную пленку высушивают на воздухе и хранят в эксикаторе.

20.2.5.1. «Окрашивание» образцов. Существуют два типа «окрашивания» — позитивное и негативное. При позитивном «окрашивании» молекулы «красителя» (соли тяжелых металлов) присоединяются к тем или иным группировкам макромолекулы [12]. В случае негативного «окрашивания», чаще называемого' негативным контрастированием, макромолекулы заключаются в тонкую пленку контрастирующего вещества. На рис. 20.13 показано, как при этом образуются области, недоступные для контрастирующего вещества и, следовательно, обладающие меньшей электронной плотностью [6, 8].

При позитивном проявлении образец вначале окрашивают в растворе, а затем помещают па сеточку. При негативном контрастировании каплю раствора, содержащего исследуемый объект, помещают на сеточку, покрытую углеродной пленкой. Обычно одной минуты достаточно, чтобы молекулы или частицы исследуемого образца адсорбировались на пленке. Затем жидкость удаляют, прикасаясь ребром сеточки к фильтровальной бумаге. Не дожидаясь полного высыхания, па сеточку наносят каплю раствора «красителя». Через —15 с раствор контраста-

554

20, РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

рующего вещества по возможности полностью удаляют фильтровальной бумагой и сеточку сушат на воздухе.

Важно, чтобы угольная пленка была смачиваемой. Это обычно бывает заметно после удаления избытка жидкости с ее поверхности. Смачиваемость пленки меняется в зависимости от атмосферных условий, продолжительности и условий ее хранения. Существуют различные способы улучшения смачиваемости, если по каким-либо причинам образец или «краситель» не растекаются по ее поверхности. Простейший из них состоит в увеличении времени, в течение которого образец находится на сеточке. Можно также просто перед использованием подержать сеточки с пленкой в увлажненной чашке Петри несколько часов. И наконец, можно подвергнуть пленку ультрафиолетовому облучению или ионной бомбардировке. Правда, в этих случаях пленка может стать слишком гидрофильной, так что капли будут растекаться по обеим поверхностям.

20.2.5.2. Оттенение. Другой метод увеличения контрастности изображений состоит в покрытии поверхности образца тонким слоем атомов тяжелого металла, испаряемого при высокой температуре. Источник испаряемого металла располагают под некоторым углом относительно образца, так чтобы поток испаряемых атомов конденсировался в соответствии с рельефом па поверхности. Контрастность обеспечивается тем, что испаряемый металл конденсируется преимущественно па выступающих частях поверхности образца. Из изображений, полученных с помощью такого метода, можно извлечь количественную информацию о распределении контрастирующего вещества по контурам структур [13]. Некоторые проблемы, возникающие при таком способе контрастирования образца можно обойти, если вращать его во время оттенения.

Разрешение на оттененных образцах невелико. Процесс оттенения происходит обычно успешно, если образец имеет неровную поверхность и вся содержащаяся в нем вода удалена. Однако разрушения нативной структуры могут быть значительными, хотя основные ее особенности и сохраняются.

20.2.6. Обработка изображений

Окончательным результатом собственно электронно-микроскопического исследования является получение изображения на фотопластинке. В некоторых случаях исследуемые молекулы могут быть организованы в виде двумерных решеток, называемых также двумерными кристаллами. Для таких объектов существуют методы, позволяющие значительно улучшить качество их изображений. Одним из инструментов для обработки изобра-

20.2. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

555

жений является оптический дифрактометр (рис. 20.15). Электронная микрофотография кристалла является двумерной дифракционной решеткой, дающей серию дифракционных пятен при освещении лучом монохроматического света (рис. 20.16). Эти пятна можно рассматривать как результат дифракции светового пучка на усредненной повторяющейся элементарно."! ячейке структуры решетки, а любые отличия в структуре каждой ячейки от усредненной — как шум, приводящий к дифракционным отражениям, лежащим вне основных пятен. Если п состав дифрактометра включить еще одну линзу, то можно воспроизвести или реконструировать исходное изображение. Еслч при этом предварительно удалить лучи, рассеянные непериодической составляющей (шумовую компоненту) введением фильтра, то удается реконструировать изображение усредненной повторяющейся структурной единицы. Аналогичным образом можно «разделить» изображение, образованное двумя наложенными друг па друга решетками. Для этого достаточно просто отфильтровать (перекрыть) дифракционные максимумы, обусловленные одной из решеток, и реконструировать изображение, используя оставшиеся дифракционные максимумы. Очевидно, что в обоих приведенных примерах существенно улучшается информативность исходных микрофотографий.

20.2.7. Трехмерная электронная микроскопия

Изображения, которые мы видим в микроскоп, представляют собой двумерные проекции трехмерной структуры исследуемого объекта. Используя гониометр (устройство, позволяющее наклонять объект в электронном пучке) можно рассматривать его под различными углами. Набор таких изображений содержит гораздо больше информации о структуре, чем одно из них. Наиболее информативным, однако, было бы реконструировать на их основе трехмерную структуру объекта. Для некоторых объектов это действительно возможно сделать, хотя такая работа занимает много времени. Математический аппарат, используемый в данном случае, сходен с аппаратом рентгеновской кристаллографии. Изображения исследуемого объекта, снятые под -различными углами, с помощью денситометра преобразуются * в числовую форму и вводятся в память ЭВМ. Рассчитанное на ЭВМ трехмерное изображение структуры можно наглядно отобразить различными способами. Обычно его представляют в виде серии срезов, подобных тем, которые получают на микротоме для залитых в полимерный носитель гистологических образцов [3, 4].

К настоящему времени хорошие трехмерные карты электронной плотности были получены для нескольких хорошо упорядоченных «окрашенных» объектов. На рис. 20.17 показана такая

656

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

л

V V

плоскость дифракции

I 1 I

ПЛОСКОСТЬ

изображения

источник света

микрофото- ф

страница 85
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
сколько стоит игольчатая хризантема в москве
Фирма Ренессанс: купить чердачная лестница - надежно и доступно!
кресло клио
Самое выгодное предложение от магазина компьютерной техники КНС Нева - хорошие компьютеры для игр - поставщик техники для дома и бизнеса в Санкт-Петербурге.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(11.12.2016)