химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

реносят из кристаллизационной ячейки в капилляр. Для предотвращения изменения ионной силы во время съемки (например, в результате высыхания) в один из концов капилляра помещают дополнительную каплю маточного раствора и открытый конец капилляра герметично заклеивают зубным воском. Для удаления избытка жидкости вблизи кристалла пользуются тонкими полосками фильтровальной бумаги. Удаление избытка жидкости снижает фоновое рассеивание рентгеновских лучей, и кристалл лучше удерживается в неком фиксированном положении'силами поверхностного натяжения следовых количеств жидкости вокруг него. В оставшийся открытым конец капилляра вводят еще одну каплю маточного раствора и закрывают его воском (рис. 20.9). Обычно начинают с того, что концы тонкостенного капилляра (длиной 30—40 мм) заранее покрывают воском так, чтобы после внесения кристалла и маточного раствора его можно было закупорить быстро и герметично.

-542

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

20J.4.5. Проверка качества кристаллов. Первоначальное тестирование кристаллов проводят с помощью съемки в прецессионной камере; в результате получают дифракционную картину, подобную той, которая представлена на рис. 20.4. Такая съемка дает общую характеристику качества кристалла. Дифракционная картина должна состоять из дискретных пятен, расположенных в узлах регулярной решетки, которая в удачных случаях достигает края изображения на фотопластинке. Разрешение определяется тем, как далеко от центра фотопластинки еще наблюдаются дифракционные пятна. Необходимо однако учитывать особенности геометрии прецессионной камеры. Так, например, при выборе слишком большого угла прецессии, позволяющего получать рефлексы до разрешения ОД нм, может оказаться, что реальное разрешение на снимках не превышает 0,6 нм. В то же время не исключено, что уменьшение угла прецессии до величины, ограничивающей разрешение, скажем до 0,3 нм, может привести к появлению на снимках рефлексов, соответствующих этому разрешению.

Другое важное свойство кристалла, которое требуется проверить,— его радиационная устойчивость. Для этого проводят серию дифракционных снимков в стандартных условиях через определенные промежутки времени. О радиационном повреждении кристалла судят по ухудшению разрешения. Кристаллы, пригодные для работы, должны выдерживать по крайней мере одну дневную экспозицию в рентгеновском пучке без каких-либо видимых изменений на прецессионном снимке.

Об изоморфизме производных говорят при сохранении постоянства параметров кристаллической решетки, которые рассчитываются с помощью параметров обратной решетки, отображенной на снимках. При наложении таких снимков с нативного и производного кристаллов дифракционные пятна должны совмещаться. Информация о расположении тяжелых атомов в элементарной ячейке и соответственно фазах дифракционных максимумов содержится в изменениях их интенсивностей. Эти изменения должны быть заметными, но не слишком большими, так как в этом случае они могут быть обусловлены конформа-ционными изменениями белковых молекул. Если же изменения в интенсивностях пятен не выявляются, следует использовать другое производное. Для определения положения тяжелых атомов применяются специальные методы белковой кристаллографии. Однако решить эту задачу удается не всегда, так как при связывании металлов из-за конформационных или ориентацион-ных изменений молекул может нарушаться изоморфизм. Другой причиной может быть множественность присоединения тяжелых атомов, что приводит к невозможности расшифровать дифракционные картины.

20.1. ДИФРАКЦИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ

543

20.1.4.6. Некоторые особенности кристаллографии больших молекул. В белковой кристаллографии структура молекул определяется на основе расчета распределения электронной плотности во всем объеме элементарной ячейки нативного кристалла. Для этого необходимо выяснить положение тяжелых атомов в производных, что и позволит рассчитать фазы всех дифракционных максимумов нативного кристалла. В ходе этой работы часто возникают серьезные затруднения, обусловленные большим размером исследуемых молекул. В отличие от кристаллографии малых молекул здесь необходимо измерять интенсивности огромного количества дифракционных максимумов, работать с большими по размеру картами электронной плотности и конструировать модели молекул, состоящих из большого числа атомов.

20.1.4J. Сбор экспериментальных данных. В ходе развития методов белковой кристаллографии были созданы дифрактометры, измеряющие с помощью счетчика интенсивности рассеянного излучения. Такой дифрактометр автоматически помещает счетчик в область нахождения дифракционного максимума и соответствующим образом ориентирует кристалл в пучке рентгеновских лучей. Разработаны также устройства, позволяющие учитывать существование дефектов кристаллической решетки и фонового рассеянного излучения. Автоматические дифрактометры позволяют проводить измерения целых наборов данных по интенсивностям дифракционных максимумов и записывать их на перфокартах, бумажных лентах или любым другим способом, позволяющим ввести данные в ЭВМ. Кроме того, дифрактометр может быть непосредственно связан с ЭВМ, что облегчает работу экспериментатора и позволяет проводить измерения с большей точностью и надежностью. В настоящее время эти приборы широко используются для структурных исследований при низком разрешении (до 0,6 нм), где число анализируемых рефлексов относительно невелико. Однако следует признать, что эффективность применения таких приборов все же недостаточно высока. Из-за большого размера элементарной ячейки белковые кристаллы отражают рентгеновское излучение в широком диапазоне углов, тогда как обычный счетчик может в данный момент времени работать только с одним^из отражений. Поэтому время, необходимое для сбора полного набора данных, часто превышает время жизни кристалла в рентгеновском эксперименте. А это в свою очередь делает необходимым объединение данных, полученных на разных кристаллах.

Для работы при низком разрешении или с белками малой молекулярной массы ограниченное время жизни кристаллов не вызывает серьезных проблем. Однако с увеличением молекулярной массы исследуемой молекулы или при повышении разреше-

544

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

ния возникает необходимость в увеличении эффективности методов сбора данных. Один из путей увеличения эффективности состоит в применении двумерного детектора, представляющего еобой периодическую решетку из счетчиков, улавливающих каждый фотон, рассеянный кристаллом. Конструкции таких приборов, работающих под контролем ЭВМ, активно разрабатываются в настоящее время.

Проблему увеличения эффективности сбора данных удалось частично решить с помощью фотометода. При использовании прецессионных фотографий наиболее сложная часть работы связана с индексированием рефлексов, т. е. с приписыванием каждому из рефлексов соответствующих индексов Миллера /г, к и L Вместе с тем при получении таких фотографий используются металлические экраны, перекрывающие рефлексы от всех слоев сферы отражения, кроме исследуемого. При этом часть информации теряется. По-видимому, более эффективна безэкранная съемка. Индексирование фотографий, полученных таким методом и являющихся суперпозицией многих слоев сферы отражения, проводят с помощью ЭВМ. Поэтому одним из этапов обработки экспериментальных данных является преобразование дифракционной картины в двумерную карту распределения оптической плотности с помощью автоматических денситометров.

20.1.5. Конструирование моделей

Обработка и анализ экспериментальных данных завершается расчетом карты распределения электронной плотности внутри элементарной ячейки кристалла, которая хранится в памяти ЭВМ. Такая карта позволяет проследить ход полипептидной цепи молекулы, но еще не выявляет структуру на уровне атомного разрешения. Для перехода к атомному разрешению необходимо построить модель, «вписывающую» полипептидную цепь в карту электронной плотности с учетом известных стереохими-ческих данных для полипептидного остова молекулы и боковых цепей образующих ее аминокислот. Для этого с помощью ЭВМ рассчитывают ряд сечений карты электронной плотности, которые в подходящем масштабе переносят на прозрачную пленку. Будучи сложенными в стопку, они воспроизводят распределение электронной плотности в элементарной ячейке кристалла. Однако без специальных приспособлений визуальный анализ структуры затруднен. Поэтому сечения или их выбранные районы укрепляются в вертикальной раме и освещаются сзади и сбоку. Перед рамой размещают полупрозрачное зеркало. Атомную модель молекулы собирают перед зеркалом так, чтобы ее зеркальное изображение совмещалось с картой распределения электронной плотности [11] (рис. 20.10).

20.1.

ДИФРАКЦИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ

845

РИС. 20.10. Устройство для конструирования проволочной модели белковой молекулы, отражающейся внутри карты электронной плотности. Полупрозрачное зеркало, находящееся в средней части устройства (между моделью и картой), убрано, для того чтобы карта электронной плотности была видна на фотоснимке.

20.1.6. Конструирование моделей

с помощью средств компьютерной графики

Конструирование моделей молекул с помощью ЭВМ, несомненно, имеет ряд преимуществ перед описанным выше способом, хотя оно и не свободно от недостатков. Компьютерная графика, бурно развивающаяся в настоящее время, способна генерировать изображения структурных элементов молекул (например, аминокислот) и совмещать их с контурами карт электронной плотности. Это достигается тем, что ортогональные изображения или стереопары структурных элементов могут выводиться на экран одновременно с трехмерной картой электронной плотности (рис. 20.11). К преимуществам таких систем следует отнести возможность автоматического уточнения положения' аминокислотных остатков, учета вандерваальсовых взаимодействий, а также возможность введения дополнительных обозначений, например прерывистых линий, показывающих расположение водородных связей. Следует признать, что использование средств компьютерной графики предпочтительно, несмотря на высокую стоимость графических устройств и их программного обеспечения, а также существующие в настоящее время ограничения на

35-703

546

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЗМ

РИС. 20.11. Структура В5-В8 участка молекулы гормона инсулина, отображенная средствами компьютерной графики. На экран одновременно выведены карта электронной плотности и модель структуры.

скорость выполнения расчетов и размеры отображаемых структур. Эти ограничения приводят к тому, что лишь относительно небольшие участки полипептидной цепи могут выводиться на экран.

20.2. Электронная микроскопия

20.2.1. Введение

В отличие от рентгеноструктурного анализа электронная микроскопия дает изображение исследуемого объекта. В настоящее время электронные микроскопы широко распространены и во многих лабораториях может быть оказана квалифицированная

20.2. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

547

помощь как по использованию приборов, так и по методам подготовки образцов для исследования. В результате «просвечивания» в электронном микроскопе получают непосредственно изображения, правильная интерпретация которых позволяет извлечь информацию о структуре изучаемых молекул. Для обычной работы исследователю бывает достаточно минимального знакомства с физическими основами метода. Разумеется, однако, что более углубленное понимание этих процессов, а также практический опыт позволяют уверенно и быстро получать надежные результаты.

Принципиальное различие между рентгеновской дифракцией и электронной микроскопией состоит в том, что пучок электронов, рассеянных объектом может быть собран электромагнитной линзой так, чтобы воспроизвести его увеличенное изображение. Поэтому электронная микроскопия чрезвычайно удобна как инструмент исследования. Электронные микроскопы получили очень широкое распространение, что позволило повысить их качество и надежность, а также сделать удобными и легкими в обращении. В настоящее время любой биохимик может иметь доступ к высококачественному прибору. На первых стадиях исследования просмотр образцов может вести квалифицированный оператор. При необходимости биохимик может продолжить электронно-микроскопическое исследование самостоятельно, получив предварительно несколько уроков у квалифицированного исследователя.

20.2.2. Разрешение и ограничения метода

В микроскопии разрешение зависит от длины волны используемого излучения. В световом микроскопе при длине волны 500 нм разрешение не превышает 250 им. Использование рентгеновской дифракции и расчет изображений с помощью ЭВМ позволяют достичь разрешения 0,1 нм при длине волны излучения 0,15 нм. В электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 100 кВ длина волны электронов составляет ~ 0,003 нм. Однако по техническим причинам реальное разрешение этих приборов достигает лишь —0,3 им, что в принципе уже позволяет различать многие детали структуры молекул. К сожалению, в- случае биологических материалов чрезвычайно трудно приготовить образцы для исследования, сохранив их структуру неизменной на уровне таких разрешений. Ограничение разрешения обусловлено не микроскопом, а существующими в настоящее время методами подготовки образцов для микроскопирования, позволяющими сохранить исследуемую структуру в вакууме при бомбардировке пучком электронов.

35*

548

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

X

ш высоковольтный кабель

v нить катода

антиконтаминацион- г над ловушка *

конден сорные линзы

f держатель образца 1 и вакуумный шлюз

линзы объектива

проекционные линзы

флуоресцентный экран

фотопластинка

РИС. 20.12. Схема расположения основных линз в электронном микроскопе. В отличие от оптического микроскопа в электронном микроскопе источник излучения располагают сверху, а увеличенное изображение формируется внизу.

Традиционным способом решения этой проблемы является «окрашивание» структур тяжелыми металлами. Поэтому обычно получаемое изображение представляет собой картину распределения окрашивающего вещества в исследуемом образце, на основании которой можно судить об особенностях молекулярной структуры объекта. Разрешение в этих случаях, как правило, не превышает 1,5 нм. Для повышения разрешения вплоть до 0,6 нм сравнительно недавно были разработаны новые методы микро-скопирования молекул. В этих методах увеличение отношения величин полезного сигнала и шума достигается, как и в случае рентгеновской дифракции, использованием упорядоченных молекулярных образований — кристаллов. Ниже будут рассмотрены принципы рутинных методов электронной микроскопии, а затем и их новейшие усовершенствования.

20.2. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

549

контрастирующее вещество

биологическая угольная молекул а пленка

тл

переплет сеточки

3 мм

медная сеточка

почернение на фотопластинке пропорционально количеству электронов, прошедших через данный участок образца

увеличенное изображение перелпета сеточки

РИС. 20.13. В электронном микроскопе образец помещают на угольную пленку, поддерживаемую медной сеточкой (медь обеспечивает хороший электрический и термический контакт преп

страница 84
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
шторки на номер
обучение монтаж и ремонт кондиционеров
кухонные ножи из японии купить
5sos первый концерт в россиии

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.05.2017)