химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

чение, рассеянное белковыми молекулами от фонового рассеивания, обусловленного, например, молекулами растворителя, и тем самым значительно повысить величину отношения полезного сигнала к шуму. Исследование кристаллических образцов может дать лишь усредненное изображение молекулы исследуемого вещества в кристаллической решетке, а не индивидуальное изображение какой-то конкретной

34*

532

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

в

а

6

РИС. 20.2. Две световые волны (а и б) с разными амплитудами и фазами и их сумма (в). Видно, что и амплитудная, и фазовая информации необходимы для суммирования.

молекулы, свободно плавающей в растворе. Дифракционная картина от кристалла (см., например, рис. 20.4) может быть зарегистрирована с помощью рентгеновской камеры подходящей конструкции. Дифракционная картина отражает трехмерное строение изучаемого кристалла. Поэтому полный набор данных об интенсивностях рассеянных лучей должен включить серию таких дифракционных картин, расположенных одна над другой и образующих так называемую обратную трехмерную дифракционную решетку. Расстояния между узлами такой решетки обратно пропорционально расстояниям между молекулами в кристалле. Интенсивности дифракционных максимумов, или пятен, содержат информацию о тонкой структуре молекулы. И если бы удалось определить относительные величины фаз волн в момент пересечения ими фотопластинки, то можно было бы рассчитать структуру молекулы и тем самым получить ее изображение. Однако определение фаз, или, как принято говорить, решение фазовой проблемы, является одной из наиболее трудоемких стадий рентгеноструктурного исследования.

20.1.3. Принципы определения структуры в рентгеноструктурном анализе

Прежде чем обсуждать теоретические и методические особенности рентгеновской кристаллографии, рассмотрим вопрос о том, какую информацию можно получить с помощью этого подхода. Рентгеноструктурный анализ хорошо сформированных кристал-

20.1. ДИФРАКЦИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ

533

РИС. 20.3. Схематическое изображение кристалла, состоящего из регулярно упакованных элементарных ячеек. Все ячейки одинаковы, и каждая образована одной или несколькими молекулами. Регулярность упаковки обусловливает кон-дентрирование рассеянных кристаллом лучей в дискретные интенсивные пики.

лов относительно малых молекул органических соединений дает возможность рассчитать распределение электронной плотности внутри элементарной ячейки кристалла. Это распределение, называемое также трехмерным фурье-синтезом, можно представить в виде серии двумерных «контурных» карт, соответствующих плоским сечениям элементарной ячейки. Интервалы, через которые делаются сечения, выбираются столь малыми, что образующие ячейку кристалла атомы видны как отдельные изолированные максимумы электронной плотности (рис. 20.5). Уровень разрешения таких карт, достигающий подчас 0,05 нм, позволяет определить структуру ab inito. Поэтому в ряде лабораторий органической химии использование рентгеновской кристаллографии для определения химической структуры соединений стало уже обычной практикой (см., например, [5]).

В случае крупных органических молекул, таких, как белки, карты электронной плотности имеют более низкое разрешение (обычно ~0,15 нм). Как видно из рис. 20.6, они не позволяют прямо разрешить отдельные атомы. В этих случаях для определения структуры необходимо привлекать дополнительную информацию, а именно схему расположения в молекуле ковалеит-ных связей. Такая схема может быть сконструирована на основе установленной ранее последовательности аминокислот в полипептидной цепи и данных об их стереохимии.

На рис. 20.7 показано, как на основе такой информации, полученной при исследовании аминокислот, может быть построена конкретная модель остова и боковых группировок белковой молекулы, заполняющих карту электронной плотности элементарной ячейки кристалла.

20.1.4. Кристаллография белков

Любое кристаллографическое исследование в конечном итоге имеет целью получить экспериментальные данные о распределении электронной плотности р(х, у, г), которую можно выразить с помощью функции Фурье:

534

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

:|1

РИС. 20.4. Дифракционная картина, полученная с помощью прецессионной камеры, от кристалла С-фикоцианииа (имеется информация об амплитудах, но не фазах дифракционных максимумов).

р(х, у, z) = ^iA(hkt)cos2n(hx+ky + tz) +

hkl

+ B(hkt) sin 2n(hx + ky + Iz)

Коэффициенты А и В связаны с интенсивностями F2(hkl) дифракционных пиков и их фазами ср:

A{hkl)=F4hkt). cos <р

B{hkl) = F4hkl)-sin ср

Основное отличие белковой кристаллографии от кристаллографии малых молекул состоит в методах определения фаз. В случае малых молекул информация о фазах может быть по-

20.1. ДИФРАКЦИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЁй

535

РИС. 20.5. Карта электронной плотности с наложенной на нее схемой структуры небольшой молекулы. Атомы на карте видны как дискретные максимумы электронной плотности.

536

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

РИС. 20.6. Участок карты электронной плотности преальбумииа. Отчетливо виден участок полипептидной цепи, образующий плоский fi-лист, тогда как отдельные атомы не разрешаются.

лучена на основе статистического анализа данных по интеиснв-ностям дифракционных пиков, полученных от кристалла. При изучении белков необходимо измерить интенсивности дифракционных пиков белкового кристалла, а также двух или большего числа кристаллов производных этого белка. Такие производные получают путем присоединения к белку атомов тяжелых металлов до или после кристаллизации. Кристалл производного должен отличаться от исходного кристалла только наличием тяжелых атомов, тогда как сам белок должен находиться в той же конформации, ориентации и упаковке, как и в нативиом кристалле. В этом случае производное называют изоморфным.

Если получены нативный кристалл и подходящее число его изоморфных производных, то следующим этапом исследования является сбор данных об интенсивностях дифракционных пиков для всех этих кристаллов. Собранная информация об интенсивностях может быть обработана таким образом, чтобы определить положение тяжелых атомов в кристаллах производных. А это в свою очередь позволяет определить фазы для всех рефлексов нативного кристалла [1].

20 J АЛ. Стадии структурного анализа. Процесс определения структуры белка можно разделить на несколько стадий (рис. 20.8); на некоторых из них могут встретиться серьезные

20.1. ДИФРАКЦИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ

537

РИС. 20.7. Объемная схема участка полипептидного остова молекулы в виде цепи с фиксированной конформацией, которая была получена вращением отдельных звеньев вокруг химических связей фиксированной длины.

затруднения, и тогда надо вернуться вновь к более ранним этапам работы (в соответствии с тем, как показано на рисунке стрелками). На рисунке не отражен также этап работы, связанный с выделением и очисткой белка, где главная роль отводится специалисту-биохимику.

20.L4.2. Получение кристаллов. Для получения рентгеновской дифракционной картины необходимы кристаллы, минимальный размер которых составляет несколько десятых долей миллиметра, т. е. значительно более крупные, чем образующиеся обычно при кристаллизации. Однако предварительная информация о том, что белок может быть получен в микрокристаллическом состоянии, чрезвычайно полезна для поиска условий и метода выращивания крупных кристаллов, пригодных для структурного

538

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

кристаллизация

получение производных

-прецессионная съемка для определения качества кристаллов ,и изоморфизма^

/

сбор данных низкого разрешения С6 с помощью дифрактометра

возможно ли определить

положение тяжелых_

атомов ?

определение фаз при разрешении 6 А

сбор даннных высокого разрешения с помощью дифрактометра или фотометодом

возможно ли уточнить положение тяжелых _ атомов при высоком разрешении 7

определение фаз при высоком разрешении

расчет карт электронной плотности с разрешением 6А, показывающих ход полипептидной цепи и внешние контуры молекулы

расчет высокоразрешающих карт электронной плотности

конструирование модели остова молекулы и боковых цепей образующих ее аминокислот

уточнение

РИС. 20.8. Кристаллографическое исследование белков. Указаны и те этапы исследования, на которых необходимо тщательно проанализировать полученные результаты, прежде чем продолжить работу.

исследования. Известно несколько методик выращивания кристаллов, но ни одна из них не универсальна. Поэтому, если исходный материал имеется в достаточном количестве, целесообразно поставить несколько параллельных экспериментов, используя различные методики. При этом приходится подбирать условия, а с учетом того, что кристаллизация белков — это мед-

20.1. ДИФРАКЦИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ

539

ленный процесс, получение кристаллов белков очень кропотливое дело, требующее от экспериментатора огромного терпения. Все существующие методики кристаллизации основаны на получении пересыщенных растворов белка и образовании в них зародышей кристаллов. Например, для получения пересыщенного белкового раствора можно добавлять насыщенный раствор сульфата аммония (высаливание). В противоположность этому простому способу можно использовать так называемое градиентное пересыщение раствора, которое обусловлено изменением температуры раствора, диффузией соли через диализную мембрану или испарением воды (диффузия через газовую фазу). Кроме того, переход раствора в пересыщенное состояние может происходить и при добавлении к раствору белка органических растворителей, например при их диффузии через газовую фазу в результате испарения [1, 9, 10]. Качество получаемых кристаллов обычно улучшается, если белок тщательно очищен от примесей, например путем изоэлектрического фокусирования [2].

Выбор конкретной методики получения кристаллов часто зависит от того, какое количество белка имеется в распоряжении экспериментатора. Для белков, хорошо растворимых в воде, обычно используют растворы с концентрацией —20 мг/мл. При кристаллизации в каплях объем одной пробы составляет ~ 10 мкл. При использовании микродиализа или микрообъемного метода работают с такими же порциями раствора. Поэтому 1 мл раствора (или 200 мг белка) может хватить па ~ 100 проб. При бережном обращении с белковым раствором и хорошем выходе кристаллов 20 мг белка может оказаться достаточным для обеспечения всего структурного исследования кристаллами или по крайней мере для выяснения возможностей дальнейшей работы.

Получение кристаллов достаточно большого размера еще не гарантирует, что структурное исследование будет успешным. Во-первых, необходимо убедиться с помощью рентгеновской съемки, например с использованием прецессионной камеры, что кристаллы в достаточной степени совершенны и, следовательно, дифракционные данные могут быть собраны вплоть до высокого разрешения. Во-вторых, кристаллы должны быть подходящего типа, так как слишком сложная (или слишком пр'остая) упаковка молекул в элементарной ячейке может сделать выяснение структуры невозможным. В-третьих, кристаллы должны быть устойчивы к действию рентгеновского излучения, так чтобы с одного кристалла можно было получить несколько снимков высокого разрешения. В-четвертых, методика получения кристаллов должна хорошо воспроизводиться, чтобы полное структурное исследование было обеспечено идентичными кристаллами,

540

20. РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭМ

поскольку полный набор дифракционных данных обычно не удается получить с одного кристалла.

20.1.4.3. Получение тяжелоатомных производных. Вообще говоря нельзя исключить, что введение в растворе в белковую молекулу тяжелого атома не повлияет на ее кристаллическую структуру и модифицированный белок будет кристаллизоваться так же, как и нативный. Однако в большинстве случаев производные, содержащие тяжелые атомы, получают при выдерживании кристаллов белка в растворах солей подходящих металлов. Это вызвано тем, что для структурного исследования необходимо, чтобы кристаллы нативного и модифицированного белка имели абсолютно одинаковую молекулярную упаковку и отличались только наличием нескольких атомов тяжелого металла в расчете на одну белковую молекулу. Поэтому целесообразно попытаться модифицировать белковые молекулы, исходно упакованные требуемым образом. Не исключено, однако, что молекулы в кристалле будут упакованы так, что соответствующие центры связывания окажутся недоступными.

Трудности в получении производных вызваны невозможностью надежного предсказания свойств белковых молекул. Поэтому приходится применять метод проб и ошибок. В случае металлсодержащих белков (металлопротеинов) (т. е. для весьма ограниченных случаев) атомы металлов могут быть замещены на другие атомы, что делает возможным получение целого ряда производных. Кроме того, к специфическому присоединению тяжелых атомов может привести химическая модификация белка, а также добавление кофакторов или ингибиторов. Однако, как правило, места присоединения тяжелых атомов удается выяснить только после расшифровки структуры; связывание этих тяжелых атомов определяется особенностями трехмерной организации боковых цепей аминокислот в кристалле. Поскольку пространственная организация экспонированных боковых цепей может зависеть от рН и ионной силы, то именно эти параметры и являются переменными при поиске условий получения производных. Особое внимание следует уделять оптимизации условий получения производных так, чтобы они приводили к воспроизводимым продуктам, а число металлических атомов, присоединившихся к каждой молекуле, было невелико. Возможно также, что выдерживание кристаллов в течение разного времени и/или в растворах с разной концентрацией одной и той же соли тяжелого металла будет иметь своим результатом два продукта с различным содержанием тяжелого атома (в одном производном этот атом присоединен по одному положению, а другом — по двум).

20.1. ДИФРАКЦИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ

541

кристалл, удерживаемый у стенки силами поверхностного натяжения воск жидкости

маточный раствор

РИС. 20.9. Размещение белкового кристалла и капель маточного раствора в тонкостенном капилляре для рентгеновской съемки.

Число положений, по которым произошло замещение, определяется в ходе кристаллографического исследования; этот параметр характеризует вероятность присутствия тяжелого металла в любой из молекул, образующих кристалл. Важно, чтобы условия получения производных воспроизводимо обеспечивали возможность получения кристаллов с высокой степенью заполнения мест связывания [1, 9].

20 J А А. Подготовка рентгеновской съемки кристаллов нативного белка или его производных. Закрепление кристаллов в капиллярах. После того как кристаллы и их производные получены, необходимо исследовать их с помощью рентгеновской дифракции, чтобы определить пригодность для дальнейшей работы. Существуют два первичных критерия: разрешение и изоморфизм. Для того чтобы можно было провести рентгеновские съемки, кристалл должен быть помещен в тонкостенный капилляр (рис. 20.9). С помощью тонкой пастеровской пипетки кристалл вместе с каплей маточного раствора пе

страница 83
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
эмигрэйс атлас бланко плитка в ванну
конфеты с пожеланиями на новый год купить
стулья белые купить
искуситель

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)