химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

208 213 ^27 234 241 257

145 156 157 161 165 170 184 191 198 214

лотную последовательность исследуемого образца. В качестве примера рассмотрим пептид A-B-C-D, где А, В, С и D — остатки модифицированных аминокислот. При электронном ударе этот пептид образует ионы А+, АВ1, АВСг и ABCD \ Возможные массовые числа N-концевых ионов, которые обычно образуются при фрагментации пептидов, приведены в табл. 19.1. Следует помнить, что при масс-спектрометрическом определении первичной структуры пептидов не удается различать между собой остатки лейцина и изолейцина.

2. Остатки аминокислот, боковая цепь которых в общем виде может быть представлена как СН2Х, где заместитель X может содержать сопряженные связи, склонны к разрыву связей С—N, сопровождающемуся миграцией атома водорода (рис. 19.4). Такой распад характерен для пептидов, построенных из остатков аспарагиновой кислоты, аспарагина, фепилалапипа, гистидина, тирозина и триптофана. Заметим, что при такой фрагментации образуются новые пептиды, аминокислотная последовательность которых начинается с остатка той кислоты, которая подверглась разрыву связей С—N, и пики ионов, характеризующих их аминокислотную последовательность, будут присутствовать в масс-спектре. Массы N-концевых ионов пептидов,

Ун-' V V"' сн< о СП,

СН - с

И I Н Н ] 4 X

РИС. 19.4. N—С-Разрыв пептидных связей в перметилированных пептидах с перегруппировкой атомов водорода.

19.6. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ МАСС-СПЕКТРОВ

525

Таблица 19.2. Массы N-концевых ионов, образующихся в результате разрыва связей С—N

Ион Масса Ион Масса

...Asp 113 ...His 135

...Asn 126 ...Туг 161

...Phe 131 ...Тгр 184

образующихся в результате разрыва связей С—N, приведены в табл. 19.2.

3. Остатки глутамнновой кислоты и глутамина, независимо от положения в цепи, обычно частично циклизуются, образуя ионы N-концевой пирролидонкарбоновой кислоты. Такая циклизация приводит к появлению в спектре иона 1 с т/г 98, а соответствующий ему N-концевой ион 2 с т/г 126 характеризуется пиком малой интенсивности или вовсе отсутствует.

снз СН, ^ _

I СН2 | СН,

си2 сг СН'

1 2

4. Распад боковых цепей некоторых аминокислотных остатков часто облегчает интерпретацию масс-спектров пептидов. Таковы, например, остатки серина и треонина, боковые цепи которых склонны к элиминированию молекул метанола. Кроме того, для остатка треонина характерен отрыв всей боковой цепи в результате разрыва С—С-связи с миграцией Н или без таковой. Аналогично ведет себя метионин, остаток которого теряет молекулу CH3SH (М 48) и/или всю боковую цепь.

19.6.3. Введение 2Н-метки

Для повышения надежности определения аминокислотной последовательности пептиды модифицируют, применяя 2Нб-ук-суспый ангидрид или 2Н3-метилиодид вместо обычных реагентов. Анализ масс-спектров этих производных приводит к более достоверным результатам. Рассмотрим следующий пример, иллюстрирующий высказанное выше. Ион с т/г 126 в масс-спектре перметилировапного ацетилпептида может принадлежать остатку N-концевой пирролидонкарбоновой кислоты, остатку аспара-гина, образовавшемуся в результате N—С-разрыва или N-koh-цевому остатку серина, который потерял молекулу метанола. Анализ масс-спектров 2Н-меченых производных позволяет одно-

526

19. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭЛЕКТРОННОГО УДАРА

значно установить природу данного иона. Если использовать для химической модификации данного пептида немеченый ме-тилиодид и 2Н6-уксусный ангидрид, то в первых двух случаях масса рассматриваемого иона не изменится, а в третьем случае вместо иона с т/г 126 образуется ион с т/г 129. Если модифицировать пептид 2Н3-метилиодидом и немеченым уксусным ангидридом, то в первых двух случаях должен образоваться ион с т/г 129, а в третьем случае —с т/г 132.

19.7. Особые случаи применения метода

19.7.1. Пептиды с защищенной N-концевой аминогруппой

Аминокислотная последовательность пептидов, не содержащих свободной а-аминогруппы, не может быть установлена классическими методами, но достаточно просто определяется масс-спектрометрически [8, 10—14]. Если предполагается, что имеется N-коицевая защитная группа, химическую модификацию проводят обычным способом, но для ацетилирования применяют 2Нб-уксусный ангидрид. В этих условиях присоединение 2Н3-ацетильной группы к N-концевой аминогруппе пептида возможно лишь при наличии ее в свободном виде. В случае неизвестной защитной группировки, ее массу определяют из массового числа N-концевого иона.

19.7.2. Определение N-концевой аминокислотной последовательности

Обычно для определения N-концевой аминокислотной последовательности белка используют секвенатор. Однако в ряде случаев, например, когда N-конец белка заблокирован или когда необходимо определить N-концевую последовательность одновременно нескольких белковых субъединиц, нужная информация более успешно получается масс-спектрометрически. Для этого 50—100 нмоль белка растворяют в 200 мкл 98%-ной муравьиной кислоты и добавляют 100 мкл уксусного ангидрида. После 30 мин стояния при комнатной температуре раствор упаривают при пониженном давлении. Формилированный таким образом белок растворяют далее в 20 мМ растворе NH4HCO3 с рН 8,5 и гидролизуют химотрипсином или эластазой. Гидролизат лиофилизуют и перметилируют. При перметилировании пептиды со свободными N-концевыми аминогруппами образуют соответствующие четвертичные аммониевые соли, которые легко удаляются из реакционной смеси при промывании ее водой. После такого промывания в реакционной массе остается лишь пептид, формилированный по N-концевой аминогруппе. Описан-

19.8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

527

ным выше способом получают масс-спектр, на основании которого устанавливают аминокислотную последовательность N-концевого пептида. Ясно, что для успешного применения описанного метода необходимо, чтобы на определенном расстоянии от N-концевого аминокислотного остатка в белке имелись пептидные связи, расщепляемые указанными ферментами с образованием пептидов, изучение которых возможно методом масс-спектрометрии.

19.7.3. Белки, содержащие остатки ^-карбоксиглутаминовой кислоты

Масс-спектрометрический метод позволяет однозначно идентифицировать остатки ^-карбоксиглутаминовой кислоты в пептидной цепи [9, 29]. Для этого пептиды ацетилируют и перметили-

N \ N \Н

' /СН2 I 7сн2

° СНз ™3

СНз СНз

—N—СН—СО- —N—СН -СО-

I ! СН2 сн2

сн-сн3 сн3

СО.СНз нзСО'С' СО>СН>

S 6

руют обычным способом (разд. 19.4.4 и 19.4.5) и модифицированную смесь анализируют методом масс-спектрометрии. Наличие N-концевого остатка f-карбоксиглутаминовой кислоты в пептиде устанавливается по наличию в его масс-спектре пиков ионов 3 и 4 с т/г 112 и 170. Присутствие в спектрах пиков ионов 5 и 6 с т/г 171 и 229 а. е. м., указывает на наличие остатка ^-карбоксиглутаминовой кислоты в пептидной цепи.

19.8. Заключение

Определение аминокислотной последовательности пептидов в смеси методом масс-спектрометрии электронного удара стало в настоящее время обычным исследованием. Химики-белковики, имеющие в своем распоряжении необходимые приборы и вла-

528

19. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭЛЕКТРОННОГО УДАРА

деющие приемами интерпретации масс-спектров, успешно применяют масс-спектрометрию в дополнение к другим методам определения аминокислотной последовательности.

Применение масс-спектрометрии особенно плодотворно при анализе трудно разделяемых пептидов, пептидов со свободными амидными группировками, а также при определении первичной структуры триптофансодержащих соединений. Масс-спектрометрия как метод определения аминокислотной последовательности просто незаменима в случае пептидов с блокированными N-koh-цами или пептидов, построенных из остатков необычных аминокислот.

В последние годы для исследования труднолетучих, полярных и термически неустойчивых соединений стала использоваться масс-спектрометрия с новым методом ионизации — ионизацией в результате бомбардировки помещенного в глицерин вещества ускоренными атомами инертных газов [30]. Масс-спектрометрия с бомбардировкой ускоренными атомами стала использоваться для определения аминокислотной последовательности немоди-фицироваиных пептидов. Указывается, что в наиболее благоприятных условиях для этого достаточно 15 пмоль пептида. Познакомиться более подробно с этим новым методом исследования можно в ряде специальных статей [31—34].

Литература

1. Morris Н. Williams D. #., Midwinter G. G., Hartley В. 5., Biochem. J., 141, 701—713 (1974).

2. Shaw W. V.} Packman L. C„ Burleigh B. D., Dell A., Morris H. R.f Hartley B. 5., Nature (Lond.), 282, 870—872 (1979).

3. Dell A, Morris H. R., Biomcd. Mass Spectrom., 8, 128—136 (1981).

4. Dell A., Morris H. R.y Biochem. Biophys. Res. Commun., 78, 847—880 (1977).

5. Bailey K. E.t Morris R. //., Biochem. Biophys. Res. Commun., 4, 1010—1014 (1977).

6. Morris H. Phil. Trans. Row Soc. London A, 293, 39—51 (1979).

7. Hughes J., Smith T. W., Kosterlitz H. W., Fothergill L., Morgan B. A.,

Morris H. /?., Nature (Lond), 258, 577—599 (1975).

8. Morris H. R„ Dell A.t Biochem. J., 149, 754 (1975).

9. Morris IF R.t Dell A., Petersen Т. E., Sotirup-Jensen L.t Magnusson S., Biochem. J„ 153, 663—679 (1976).

10. Stone J. V., Mordue W., Bailey K. Morris tf. R.t Nature (Lond.) 263, 207—211 (1976).

11. Hofmann Т., Kawakami M., Hiichman A. F W., Harrison J. E.t Dorrin-gton K. Can. J. Biochem., 5, 737—748 (1979).

12. Nystrom L.-E., Lindberg V., Kendrick-Jones J., Jakes FEBS Lett., 101, 161 — 165 (1979).

13. Fitton F E., Dell A, Shaw W\ V., FEBS Lett., 115, 209—215 (1980).

14. Vinson G. P., Whitehouse B. Dell A., Etienne А. Т., Morris IF R.t Nature (Lond.), 284, 464—467 (1980).

15. McDonagh R. P., McDonagh F, Petersen Т. E., Thorgersen H. C., Skorsten-gaard K.} Sottrup-Jensen L.t Magnusson S., Dell A., Morris H. R., FEBS Lett, 127, 174—178 (1981).

ЛИТЕРАТУРА

529

16. Das В. С, Gero 5, D., Lederer E., Biochem. Biophys. Res. Commun., 29, 211—213 (1967).

17. Lederer ?, Pure Appl. Chem, 17, 489—517 (1968).

18. Vilkas E., Lederer Tetrahedron Lett, 26, 3089—3092 (1968).

19. Aplin R. Т., Eland /, Jones J. tf. Org. Mass Spectrom, 2, 795—799 (1969).

20. Morris H. /?, Geddes A. /, Graham G. A, Biochem. J, 111, 38 (1969).

21. Morris H. R.y FEBS Lett, 22, 257—260 (1972).

22. Morris H. R., Dickinson R. /, Williams D. tf, Biochem. Biophys. Res. Commun, 51, 247—255 (1973).

23. Yamada 5, Itano H. A, Biochim. Biophys. Acta, 130, 538—540 (1966).

24. Morris H. R.t Williams D. #, Ambler R. P., Biochem. J, 125, 189—201 (1971).

25. Morris H. R„ Bailey К. E., Harding A. G. L, Bjur R. A., Dann /. G , King R. W.9 Biochem. J, 137, 409—411 (1974).

26. Morris H. R., Etienne А. Т., Dell A., Albuquerque R, J. Neurochcm, 34r 574—582 (1980).

27. Dell A., Morris H. Biochem. Biophys. Res. Commun, 61, 1125—1132 (1974).

28. Morris H. R., Dell A, In: Instrumentation in Amino Acid Sequence Analysis/ Perham R. N. (Ed.), Academic Press London, New York, San Francisco, pp. 147—191 (1975).

29. Thorgersen H, C, Petersen T. E.f Sottrup-Jensen L., Magnusson 5, Morris H. R., Biochem. J, 175, 613—627 (1978).

30. Barber Af, Bordoli R. 5, Sedgwick R. D.t Tyler A. A., Nature (Lond.), 293, 270—273 (1981).

31. Morris H. R., Panico M., Barber M., Bordoli R. S, Sedgwick R. D., Tyler A. A, Biochem. Biophys. Res. Commun, 101, 623—631 (1981).

32. Rinehart K. L, Jr., Guadioso L. A, Moore M. L, Pandey R. C, Cook A C. Jr.t Barber M., Sedgwick R. D., Bordoli R. S, Tyler A. A, Green B. A, J. Am. Chem. Soc, 103, 6517—6520 (1981).

33. Morris H. R., Dell A, Etienne А. Г, Judkins Af, McDowell R. A, Panico Af.. Taylor (7. W., Pure Appl. Chem, 54, 267—279 (1982).

34 Williams D. //, Bradley С. V., Santikarn S., Bojesen G, Biochem. J, 20U 105—117 (1982).

34-703

Глава 20

РЕНТГЕНОВСКАЯ КРИСТАЛЛОГРАФИЯ И ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Д. ДОВЕР (D. DOVER, Department of Biophysics, King's College, London, Strand, London WC2R 2LS, U.K.)

20.1. Дифракция рентгеновских лучей

20.1.1. Введение

Окончательный результат, к которому стремится исследователь-биохимик, состоит в выявлении динамической трехмерной структуры молекулы изучаемого соединения, отражающей все конформационные изменения, происходящие в процессе ее функционирования. Единственный метод, который сегодня дает детальную информацию о пространственной организации белковых молекул, это рентгеноструктурный анализ. Однако и он позволяет установить в лучшем случае лишь ограниченное число конформационных состояний сложного химического соединения. С помощью других физических методов можно оценить, например, форму, размеры, асимметричность молекулы или наоборот детально исследовать строение только небольшой части макромолекулы. В отличие от этих методов электронная микроскопия позволяет получать трехмерное изображение белковых молекул, хотя уровень разрешения деталей их структуры значительно хуже, чем в случае рентгеноструктурного анализа.

20.1.2. Получение изображений молекул — разновидность структурного анализа

При рассмотрении образца в обычном световом микроскопе рассеянный объектом свет фокусируется объективом, благодаря чему формируется увеличенное изображение (рис. 20.1). При рассеянии от образца световых волн они претерпевают фазовые изменения, и линзы объектива, фокусируя их, сохраняют полученное после рассеяния соотношение фаз. Благодаря этому при рекомбинации лучей формируется изображение объекта (рис. 20.2). Разрешение, т. е. минимальный размер деталей, воспроизводимых в таком изображении, ограничен длиной волны используемого света (обычно —600 нм). Более мелкие де-

20.1. ДИФРАКЦИЯ РЕНТГЕНОВСКИХ ЛУЧЕЙ

53t

экран для наблюдения РИС. 20.1. Схема светового микроскопа со стеклянными линзами, собирающими рассеянный образцом свет и реконструирующими увеличенное изображение объекта. Такая конструкция позволяет сохранить фазы рассеянных лучей в их исходном соотношении.

объектив

объект

тали могли бы быть видны в микроскоп, работающий, например на рентгеновском излучении с длиной волны 0,154 нм (CuKa-лииия). К сожалению, линзы, способные фокусировать рентгеновские лучи, еще не созданы, и поэтому получить изображение в таких условиях нельзя. Можно лишь зарегистрировать интенсивности лучей, рассеянных изучаемым объектом, например, с помощью фотопластинки. Однако фазы этих лучей остаются неизвестными, и поэтому невозможно реконструировать изображение объекта. Объект, который до сих пор рассматривался, мог состоять из многих молекул, находящихся в различных ориентациях, например состояние молекул белка в растворе. Изображение такого образца воспроизвело бы каждую из молекул в ее конкретной ориентации. Собирая, однако, данные только об интепсивностях лучей, невозможно выделить лучи, рассеянные той или иной молекулой или окружающими их молекулами растворителя. Это можно сделать, используя кристаллические образцы, где все молекулы находятся в одинаковой ориентации ^рис. 20.3). Благодаря регулярности кристалла лучи, рассеянные этими молекулами, концентрируются в отдельные дифракционные пики, что позволяет отделить излу

страница 82
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
накладка на автомобильное сиденье ортопедическая
заказать торт со ступино в мещерино цена
Рекомендуем фирму Ренесанс - лестница на второй этаж калькулятор - качественно и быстро!
накладки на ступени с подсветкой

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.04.2017)