химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

о контролироваться. С этой целью метилиодид используют для метилирования пептида, спектр метилпроизвод-ного которого хорошо известен. Сравнением масс-спектров стандартного и анализируемого соединений оценивается количество примесей в используемом реактиве. При наличии большого количества примесей применять реактив нецелесообразно. Попытки очистить реактив перегонкой приводят к удалению стабилизирующих реактив добавок. Диметилсульфоксид очищают, перегоняя над гидридом кальция при пониженном давлении, хранят тоже над гидридом кальция. При использовании гидрида натрия, поставляемого обычно в виде суспензии в масле, реактив необходимо предварительно многократно промыть высушенным над натрием диэтиловым эфиром, а затем

518 19- МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭЛЕКТРОННОГО УДАРА

О О

It ii

NH2 СН С NH <^Н —С—.....................СО:Н

R (сн2)4

I

NH2

hcHjCOhocHjOH

О О

ii ii

CHj С NH ЧГН ~С NH -СН—С— ........С02Н

ii i i

° R (СН2)4

I

NH

I

СН3

I ] сн, s сн^

°

1: cHii"?5c

CHj О СНз р

СН, С N СН С N СН С- ..............С02СН,

и . i

О R (СН2)4

I

N -СН3

I

с-^о I

СНз

РИС. 19.1. Ацетилирование и исчерпывающее метилирование пептидов для масс-спектрометрирования [22].

, NHjN^HjO/HjO (1.1) / rvx rH__pit —Ш

/-CH2-CH2-CH2-NH-CX —---^/~CH2-CH2—CH2 гнт

1 NH2 РИС. 19,2. Превращение аргининовых остатков в остатки орнитина [22].

19.4. СПОСОБЫ ПОДГОТОВКИ ПРОБ

519

просушить в вакууме. Полученный серый порошок может длительное время (до года) храниться в герметически закрытом сосуде при условии лишь кратковременного воздействия атмосферного воздуха в моменты открывания.

19.4.2. Лабораторная посуда

Чтобы свести к минимуму потери исследуемых веществ, все химические превращения следует проводить в одной и той же небольшой (100x10 мм) стеклянной пробирке с притертой пробкой. Для добавления реактивов лучше всего использовать пастеровские пипетки.

19.4.3. Гидразинолиз

К 5—100 нмоль пептида добавляют 50 мкл водного раствора гидразин-гидрата (1:1) и раствор выдерживают в течение 12 мин при 80 °С. После этого реакционную массу охлаждают, добавляют 50 мкл воды, замораживают раствор жидким азотом или смесью этанола с сухим льдом и вакуумиру-ют с помощью форвакуумного насоса до полного улетучивания влаги (удобно пользоваться лиофильной сушилкой). Замороженную таким образом пробу медленно расплавляют и доводят ее температуру до комнатной. Такая процедура сопровождается выделением растворенных в реакционной массе газов. Остатки гидразингидрата удаляют, добавляя дважды к образцу по 50 мкл воды, которую упаривают в вакууме.

19.4.4. Ацетилирование

Обработка уксусным ангидридом при комнатной температуре в течение одной минуты приводит к защите а-аминогруппы пептида, а в течение трех часов — к полной модификации е-аминогрупп. В присутствии подходящего основания обе аминогруппы ацетилируются за время около одной минуты. Ниже приведены две методики ацетилирования, каждая из которых пригодна для модификации пептидов с неизвестным аминокислотным составом.

19 А АЛ. Продолжительное ацетилирование. Образец растворяют в 100 мкл воды, к раствору добавляют 500 мкл метанольного раствора уксусного ангидрида (3:1) и реакционную массу выдерживают в течение 3 ч.

Избытки реагентов удаляют вакуумированием, при котором не наблюдается перебрасывания реакционной массы.

19 А А.2. Кратковременное ацетилирование. Пробу растворяют в 100 мкл раствора бикарбоната натрия, приготовленного так, чтобы в 1 мл воды содержался 1 мг соли, и по истечении 30 с добавляют раствор уксусного ангидрида в метаноле (1 :3). Примерно через минуту реакционную массу откачивают сначала водоструйным насосом, принимая во внимание возможность перебрасывания, а затем форвакуумным или применяют лио,4)ильную сушку.

19.4.5. Перметилирование

Ацетилпептиды перметилируются следующим образом. Сначала готовится необходимое основание — метилсульфинильный карбанион. Для этого к 3— 4 мл диметилсульфоксида добавляют гидрид натрия (два полных микрошпателя) и реакционную массу выдерживают 20 мин при 90 °С. О ходе реакции судят по интенсивности окрашивания раствора и по скорости выделения пузырьков водорода. Если за это время реакционная масса приобретает оран-

520

19. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭЛЕКТРОННОГО УДАРА

жево-коричневый цвет и выделение водорода практически прекращается, то считают, что реакция прошла до конца. Если выделение водорода прекращается до появления нужного окрашивания, то к реакционной массе следует добавить гидрид натрия (еще один микрошпатель) и продолжать реакцию до приобретения реакционной смесью нужной окраски. Если в процессе проведения реакции раствор окрашивается в зеленый или красный цвет, то его следует вылить. По окончании реакции массу охлаждают и центрифугируют 10 мин со скоростью 3000 об./мин. При этом в верхней части пробирки собирается жидкость цвета светлого меда, которая содержит необходимое для дальнейшего применения основание.

К растворенному в капле диметилсульфоксида ацетилпептиду добавляют 20—30 капель раствора, содержащего мстилсульфинильный карбанион. Чтобы убедиться, что основание добавлено в избытке, капают реакционной смесью на кристаллик трифенилметана, который в этом случае окрашивается в глубокий красный цвет. Примерно через минуту после добавления избытка основания к реакционной массе добавляют 500 мл метилиодида и проводят метилирование в течение 70 с [21, 22]. По прошествии указанного времени реакцию останавливают добавлением 2 мл воды. Перметилированные ацетил-пептиды сразу же экстрагируют 1 мл хлороформа, который предварительно дважды промывают 2 мл воды, и хлороформный экстракт упаривают в потоке азота. Для окончательного удаления следов воды и хлороформа продукт вакуумируют.

19.4.6. Запись масс-спектров

Перметилированный ацетилиептид растворяют в капле хлороформа и раствор тщательно переносят в испаритель, укрепленный на металлическом штоке, который служит для введения пробы в ионный источник масс-спектрометра. Хлороформ отгоняют из испарителя, продувая через раствор воздух, который поступает из оттянутого конца пастеровской пипетки. После испарения хлороформа испаритель посредством штока вводится в ионный источник, в котором происходит испарение исследуемого вещества. Наилучшие результаты достигаются, когда испаритель не имеет специального нагревательного элемента, а подогревается за счет тепла, излучаемого нагретыми стенками ионизационной камеры. Использование испарителя с автономным обогревом при анализе смесей оказывается малоэффективным. Поддерживая температуру ионизационной камеры ~100°С, испаряют из анализируемого образца такие легколетучие примеси, как диметилсульфоксид или углеводороды. Если при этом давление в области ионизационной камеры повышается, то шток на время выдвигают, ждут пока давление понизится до нужного уровня и снова вводят образец. После испарения всех легколетучих примесей, начинают испарять исследуемое вещество. Делают это следующим образом. Выдвинув испаритель из ионизационной камеры, включают устройство, повышающее ее температуру, и с равномерной скоростью повышают температуру ионизационной камеры до 350°С. После нагревания ионизационной камеры на каждые 30 °С вводят испаритель и несколько раз записывают масс-спектр в диапазоне массовых чисел от m/z 1000 до mjz 90.

19.5. Общие принципы масс-спектрометрического определения аминокислотной последовательности пептидов и белков

Главное достоинство масс-спектрометрического определения аминокислотной последовательности заключается в возможности анализа смесей пептидов [24, 25], в противном случае масс-спектрометрия не могла бы конкурировать с классическими ме-

19.5. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА

521

тодами установления первичной структуры пептидов и белков, потому что ее использование обходится намного дороже, чем применение ручного дансил-эдмановского метода анализа, чувствительность которого порой оказывается более высокой. Хи-микам-белковикам хорошо известно, что процесс выделения индивидуальных пептидов из смеси, образующейся при ферментативном расщеплении белков, является именно той стадией, которая лимитирует скорость определения аминокислотной последовательности пептидов классическими методами. Несмотря на то что первичная структура крупных пептидов в настоящее время обычно устанавливается автоматически с применением секвенаторов, для нахождения мест встраивания этих фрагментов в белковую цепь всегда приходится подвергать молекулу-белка более глубокому неспецифическому расщеплению с образованием многих небольших пептидов. Для того чтобы установить аминокислотную последовательность этих коротких пептидов ручным способом, необходимо предварительно разделить смесь на индивидуальные компоненты. При определении структуры этих пептидов методом масс-спектрометрии необходимость выделения отдельных компонентов отпадает вовсе, а в случае сложных смесей достаточно грубого разделения смеси на отдельные фракции.

Исследуемую фракцию после модификации описанным выше способом помещают в испаритель и посредством штока вводят в ионный источник. Благодаря различной летучести модифицированных пептидов при плавном нагревании из смеси дробно возгоняются индивидуальные компоненты, и поэтому масс-спектры, которые записываются в определенные промежутки времени, обычно характеризуют те пептиды, содержание которых в газовой фазе является преимущественным. Сравнивая масс-спектры образца, получаемые при различных температурах, удается однозначно определять аминокислотную последовательность индивидуальных пептидов смеси. Такой подход дает хорошие результаты при анализе смесей, содержащих до пяти различных пептидов. Ниже будут обсуждены общие приемы установления первичной структуры белков, которые позволят наиболее эффективно использовать преимущества масс-спектрометрии при установлении аминокислотной последовательности; коротких пептидов. При этом следует помнить, что для достижения максимального эффекта при установлении первичной структуры неизвестного белка всегда следует комбинировать классические и масс-спектрометрический методы. Такой подход может выглядеть следующим образом:

1) N-концевая аминокислотная последовательность белка или крупных пептидов определяется с помощью автоматических секвенаторов;

522

19, МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭЛЕКТРОННОГО УДАРА

2) пептиды, образующиеся в результате специфического ферментативного расщепления белка трипсином или химотрипсином, структурно анализируются ручным дансил-эдмановским методом;

3) аминокислотная последовательность коротких пептидов, образующихся при неспецифическом расщеплении молекулы белка эластазой или субтилизином с целью установления мест встраивания крупных пептидов в белковую цепь, определяется масс-спектрометрически при анализе их смесей [2, 4, 25].

В ряде случаев как метод решения структурных задач следует предпочесть масс-спектрометрию. Например, для определения нуклеотидной последовательности участка ДНК, соответствующего определенному гену, потребуется затратить несравненно меньше усилий, если каким-либо методом определена частичная аминокислотная последовательность белка, первичную структуру которого он кодирует. Такая информация может быть получена в течение нескольких недель с использованием масс-спектрометрии. Масс-спектрометрия — идеальный метод быстрой оценки степени гомологичности родственных белков [4]. Кроме того, масс-спектрометрия — это и непревзойденный метод структурного анализа амидов и определения положения остатков триптофана в пептидной цепи. План эксперимента при определении аминокислотной последовательности с применением масс-спектрометрии можно описать следующим образом:

1) белок неспецифически расщепляется эластазой или субтилизином. Глубина гидролиза проверяется аналитическим электрофорезом при рН 6,5;

2) основная масса коротких пептидов отделяется от негид-ролизованного белка и крупных пептидов гель-фильтрацией;

3) смесь коротких пептидов разделяется колоночной хроматографией на катионитах, например на дауэксе [4, 25], или высокоэффективной жидкостной хроматографией. Наилучшее разделение на катионитах достигается при элюировании смесью пиридина с уксусной кислотой [4, 25], а при высокоэффективной жидкостной хроматографии — смесью уксусной кислоты с про-панолом [26]. Присутствие пептидов в элюенте устанавливается аналитическим электрофорезом (для анализа используется — 1 /100 каждой фракции);

4) в результате отбора определенных фракций и их высушивания готовятся пробы, содержащие в смеси до пяти пептидов;

5) пробы химически модифицируются и анализируются методом масс-спектрометрии.

Применение такого подхода позволяет опытному исследователю примерно в течение двух месяцев получить 70% информации о аминокислотной последовательности белка с Л1^20 000.

19.6. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ МАСС-СПЕКТРОВ

523

о сн,

il I *

.СН—С— N-CH-

I I

i

сн,

.....СН-С^О+ ^ N-CH- .....

РИС. 19.3. С—N-Разрыв пептидных связей в перметилированных пептидах.

19.6. Интерпретация масс-спектров

19.6.1. Введение

Однозначное установление аминокислотной последовательности пептида путем расшифровки сложного масс-спектра требует определенного опыта, который приобретается лишь в результате длительного предварительного изучения спектров большого количества пептидов известного строения. В этом разделе делается попытка изложить принцип интерпретации масс-спектров и в связи с этим коротко излагаются основные пути фрагментации пептидов при электронном ударе. Более подробно с установлением аминокислотной последовательности пептидов методом масс-спектрометрии можно ознакомиться в ряде ранее опубликованных работ [1, 3, 6—10, 24, 27, 28].

19.6.2. Пути фрагментации пептидов

1. Фрагментация перметилированных ацетил пептидов при электронном ударе обусловлена в основном разрывом амидных связей, т. е. связей С—N (рис. 19.3). Образующиеся в результате разрыва этих связей ионы как раз и характеризуют аминокислотную последовательность пептида. Разность масс таких ионов отвечает величинам, характеризующим массы аминокислотных остатков. Сначала находят в масс-спектре ион, характеризующий остаток N-копцевой аминокислоты, массовое число т/г которого обычно лежит в интервале 114—257, а затем прибавляют к этому массовому числу массовые числа аминокислотных остатков, которые могут входить в состав пептида, и находят в спектре ионы больших массовых чисел, которые определяют аминокис-

4- е

XH-

1

о)СН3

1Г I -C-N-CH-

524

19. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭЛЕКТРОННОГО УДАРА

Таблица 19.1, Массы N-концевых ионов и их аминокислотных остатков в пептидной цепи в масс-спектрах электронного удара ацетилированных

перметилпептидов

Аминокис- Масса N-кон- Масса ами- Аминокис- Масса N-кон- Масса ами-

лота цевого иона нокислотного лота цсвого иона нокислотного

остатка остатка

Gly 114 71

Ala 128 85

Pro 140 97

Val 156 113

Ser 158 115

Leu 170 127

Thr 172 129

Cys 174 131

Asp 186 143

Met Asn Glu Phe His Gin Orn Tyr Lys Trp

188 199 200 204

страница 81
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
http://help-holodilnik.ru/info/Remont_xolodilnikov_v_Yubileynom
оборудование для 3д кинотеатра цена
жозеф жозеф
щит free tech fau comfort

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.07.2017)