химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ющими несколько субъеди-пнц. Для исследования олигомеров, состоящих из субъедипиц разных типов, используют метод диссоциации с последующим анализом методом электрофореза в ПААГ, денситометрию белков, окрашенных кумасси, введение радиоактивной метки. Если удалось оценить молекулярные массы олигомера и мономеров, несложно рассчитать абсолютное количество субъедипиц. С целью определения соотношения мономеров может применяться и аминокислотный анализ.

Поскольку при определении молекулярных масс белков ошибки могут достигать существенной величины, полученные данные следует оценивать с известной осторожностью. Важное значение имеет симметрия молекулы олигомера. Наиболее часто встречаются димерные и тетрамерные структуры, вместе с тем есть множество примеров гексамеров, октамеров и додекамеров. Известно всего несколько работ, где упоминается о существовании тримеров, пентамеров и гептамеров [63]. Таким образом, если расчеты показывают, что олигомер включает одиннадцать мономеров, вероятнее всего, мы имеем дело с артефактом. О структуре крупных олигомеров судят по данным рентгеноструктурного анализа и электронной микроскопии [13, 131].

1.4.1. Определение состава олигомера по молекулярным массам мономеров

Если молекулярные массы олигомера и мономера установлены,, например с помощью методов, рассмотренных в разд. 1.2 и 1.3.1, состав олигомера рассчитать несложно. Например, если олигомер с молекулярной массой Мг включает мономеры двух типов аир (молекулярные массы Ма и д4р), то состав его рассчитывают по формуле

ПъМъ+щМ^Мг

4*

?2 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

где па и щ — число субъединиц а и р. Следует помнить, что даже в самых благоприятных случаях ошибка определения молекулярных масс олигомера и мономеров составляет 5—10%. Кроме того, следует критически относиться к абсолютной точности таких эмпирических методов, как электрофорез в ПААГ — ДСН и гель-фильтрация. Исследуемые белки могут иметь иные по сравнению с белками-маркерами гидродинамические свойства или необычный состав, что существенно повлияет на их поведение в процессе анализа.

Рассмотрим, в какой мере ошибки в 5 и 10% повлияют на оценку числа субъединиц. Для олигомера с молекулярной массой 300 000, содержащего 6 субъедипиц с молекулярной массой 50 000, при ошибке в 5% расчет дает величину 5,4—6,6, и, следовательно, с достаточной достоверностью можно считать, что речь идет о гексамере. Однако при ошибке 10% расчет дает величину 4,9—7,3, т. е. число мономеров можно принять равным 4, 6 или 8. Достоверность определения стехиометрического соотношения мономеров ухудшается, если в состав олигомера входит 2 и более различных типов мономеров.

1.4.2. Сшивание субъединиц бифункциональными реагентами

При определении числа мономеров в олигомере все большее распространение получает метод, основанный на сшивании мономеров бифункциональными реагентами с последующим анализом продуктов реакции с помощью электрофореза в ПААГ — ДСН [44]. Электрофореграмма представляет собой набор зон, соответствующих компонентам смеси, молекулярные массы которых кратны молекулярной массе мономера вплоть до полного ¦олигомера. В случае олигомеров, составленных из идентичных или почти идентичных мономеров, число основных зон должно соответствовать набору мономеров.

С помощью бифункциональных реагентов можно определять четвертичную структуру олигомеров [72, 82], однако этот вопрос требует специального обсуждения. Тем не менее, когда речь идет о простой системе — тетрамере, гексамере или окта-мере,— имеет смысл использовать такой подход для определения расположения мономеров в олигомере.

В подавляющем большинстве экспериментов в качестве сшивающего агента используются бисиминоэфиры карбоновых кислот с различной длиной цепи, и в первую очередь диметиловый эфир иминопробковой кислоты (п = 6). Эти высокоспецифические модифицирующие реагенты легко взаимодействуют с а- и Б-аминогруппами остатков лизина с образованием амидинов (р/Са>11). Реагенты иного типа включают ацилазиды, реагенты на сульфгидрильные группы, глутаровый альдегид [132]. При-

1.4. СООТНОШЕНИЕ МОНОМЕРОВ В ОЛИГОМЕРЕ

53

меняют также относительно устойчивые бисиминоэфиры янтарной кислоты, образующие стабильные или гидролизуемые поперечные связи [77].

+ NH2 +NH2 fNH2 +NH2

i i

2RNH2+CH3 О -С (СНА С О СН3 * KNH С (СНА С NHR

+

2СН3ОН

Бисиминоэфиры гидролизуются в растворе по двум или одной функциональной группе, тогда как другая может быть связана с аминогруппой белка. Некоторые молекулы реагента взаимодействуют с двумя молекулами белка, образуя как внутри-, так и межмолекулярные ковалентные связи [132].

На молекулярную массу конечного продукта существенное влияние оказывают только межмолекулярные связи, что легко обнаружить в денатурирующих условиях. Поперечные связи в пределах субъединиц (аналогично дисульфидным связям) удерживают полипептидную цепь в свернутом состоянии, уменьшая тем самым гидродинамический объем и кажущуюся молекулярную массу. Некоторые из продуктов, полученных при сшивании тетрамеров типа а4 и 0^2, представлены на рис. 1.6. Распределение полимеров по молекулярным массам определяется числом и положением поперечных связей.

Тем не менее по «спектру» молекулярных масс перекрывающихся полимеров можно определить число мономеров в простом олигомере. Олигомеры, составленные из мономеров с различными молекулярными массами (например, типа агЕЬ), образуют более сложный набор полимеров, и интерпретация полученных результатов бывает затруднительна.

1.4.2.1. Условия проведения реакции белков с бифункциональными реагентами. При взаимодействии белков с бифункциональными реагентами могут меняться рН среды, расстояние между функциональными группами реагента, концентрация реагента и белка.

Влияние рН среды. Бисиминоэфиры взаимодействуют с е-аминогруппами остатков лизина (р/Са 9,5—10) и а-аминогруп-пой N-концевой аминокислоты при рН>8, т.е. с аминогруппами, находящимися в непротонированной форме. Продукты этих реакций — амидины с р/Са>11, поэтому в области рН<8 модифицированный белок сохраняет положительный заряд. В области рН<8 возможны побочные реакции [132, 165], в то время как выход амидинов достигает максимума при рН>10. В этих условиях многие олигомеры диссоциируют, поэтому реакцию рекомендуется проводить в диапазоне рН 8—10. Если

54 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

Тетрамер Компоненты реакционной смеси

мономер димер тример тетрамер

Молекулярная масса

РИС. 1.6. Состав смеси полученной при частичном сшивании бифункциональными реагентами тетрамеров а4 и ссгрг-

олигомер устойчив при высоких рН хотя бы в течение 1—2 мин, то, поскольку реакция идет с высокой скоростью, вполне возможно проводить модификацию в этой среде. Вообще говоря, имеет смысл изучать роль рН среды, исследуя состав продуктов реакции [162, 171].

Расстояние между функциональными группами реагента. Расстояние между функциональными группами выбранного реагента определяется расположением аминогрупп в нативном олигомере. Известные бифункциональные реагенты — диметило-вые эфиры двухосновных иминокарбоновых кислот — имеют следующие параметры [45, 132]:

Кислота Расстояние между функцио-

нальными группами, нм

Иминомалоновая 0,5

Иминоянтарная 0,6

Иминоадипиновая 0,9

Имннопробковая 1,1

Иминододецнловая 1,5

1.4. СООТНОШЕНИЕ МОНОМЕРОВ В ОЛИГОМЕРЕ

55

При работе с одним реагентом можно прийти к неоднозначным пли даже ошибочным выводам. Лучше всего проводить исследования с несколькими реагентами — членами одного гомологического ряда.

Концентрация бифункционального реагента. От концентрации бифункционального реагента непосредственным образом зависит степень сшивки олигомера, иными словами, чем выше концентрация, тем выше степень сшивки. Однако отмечено [132], что избыток сшивающего реагента по отношению к количеству олигомера не оказывает существенного влияния на скорость реакции, а чрезмерный избыток, по-видимому, вызывает протекание нежелательных побочных реакций. Если, увеличивая концентрацию реагента, не удается повысить степень сшивки олигомера до желаемого значения, это может свидетельствовать о преимущественном образовании внутримолекулярных поперечных связей.

Концентрация белка. Во избежание полимеризации олигомеров концентрация белка в реакционной смеси должна быть низкой. Если известна молекулярная масса олигомера, то приз-паком образования межмолекулярных (между молекулами олигомера) связей будет присутствие в смеси компонентов с молекулярной массой, превышающей М олигомера. Воспрепятствовать образованию поперечных связей (сшивок) олигомеров можно с помощью предварительной иммобилизации белка на нерастворимой матрице [135], например благодаря образованию дисульфидной связи с тиольными группами сефарозы 4В (разд. 3.2.5); далее можно провести обработку бисиминоэфира-ми [32].

L4.2.2. Методики.

Получение бисиминоэфиров [108]. Диметиловые эфиры ими-ноадипиновой и иминопробковой кислот поставляются в качестве продажных реактивов. Остальные бисиминоэфиры могут быть синтезированы из доступных динитрилов по типовой методике [108].

Растворяют 0,5 г нитрила пробковой кислоты в смеси 2 мл метанола (высушенного с помощью молекулярного сита) и 15 мл этилового эфира при 0°С. Через раствор в течение 30 мин пропускают сухой НО и выдерживают реакционную смесь при 4°С в течение 24 ч. Прибавляют 10 мл сухого диэтилового эфира, выпавшие кристаллы тщательно промывают сухой смесью метанол —эфир (1:3) без доступа влаги. Полученный гидрохлорид бисиминоэфира (выход 0,81 г, 81%) используется без дополнительной перекристаллизации.

Получение амидинированных белков [44]. Образец белка растворяют (до концентрации 0,5 мг/мл) или тщательно диали-

56

]. ОПРЕДЕЛЕНИИ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

зуют против буферного раствора состава: 0,2 М триэтанол-амин + HCl (рН 8,5). Непосредственно перед проведением реакции растворяют гидрохлорид бисиминоэфира в том же буфере (концентрация 10 мг/мл) и с помощью NaOH устанавливают рН 8,5. Рассчитанное количество раствора реагента прибавляют к раствору белка (так, чтобы концентрация реагента в реакционной смеси составила 1 мг/мл) и выдерживают реакционную смесь при 20°С в течение 3 ч. Если реагент необходимо прибавлять порциями, то вторую порцию вносят спустя 30 мин после начала реакции.

При поиске оптимальных условий проведения реакции концентрацию белка варьируют в интервале 0,1—5,0 мг/мл, а концентрацию бисиминоэфира в реакционной смеси — 0,2—5 мг/мл. Величину рН буферного раствора можно варьировать от 8 до 10,5. При рН 8—8,5 используют 0,2 М триэтаноламин — НС1, при рН>8,5 — 0,2 М боратный буфер. Для; повышения буферной емкости (сохранения рН при добавлении реагентов) используют довольно концентрированные буферные растворы, которые не должны содержать первичных аминов.

Спустя три часа избыток реагента полностью гидролизуется. При определении кинетики реакции отбирают аликвотные пробы, а реакцию прерывают, добавляя двукратный избыток (по отношению к реагенту) гидроксиламина.

Электрофорез в ПААГ— ДСН. Продукты реакции исследуют с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН (разд. 1.3.1.1) или с помощью гель-фильтрации и ультрацентрифугирования в присутствии денатурирующих агентов. Поскольку, по всей вероятности, поперечно-сшитые продукты будут иметь Af>100 000, готовят 5%-ный гель, а образец наносят в количестве 50 мкг. В случае простых олигомеров, содержащих идентичные или почти идентичные мономеры, состав определяют по количеству основных зон. Если степень сшивки невелика, молекулярные массы гибридных молекул, кратные молекулярной массе мономера, можно найти по градуировочному графику. Высокое содержание поперечных связей может быть причиной аномального поведения полимеров при электрофорезе.

Если концентрация белка в образце достаточно высока, пробу наносят (в случае использования ступенчатой системы) без предварительного диализа. Возможно, что образец будет необходимо сконцентрировать, лучше всего это сделать путем осаждения трихлороуксусной кислотой. Осадок растворяют в буфере для образца (раздел 1.3.1.1).

1.4.2.3. Ограничение возможностей метода. С помощью сшивания бифункциональными реагентами был изучен ряд олигомер-ных белков известного состава. В принципе метод может при-

1.4. СООТНОШЕНИЕ МОНОМЕРОВ В ОЛИГОМЕРЕ

57

меняться в отношении любого олигомерного белка, однако иногда таким путем не удается получить необходимой информации. Образование поперечных связей может не идти из-за недостатка аминогрупп, их неудачного расположения, наличия защитных группировок. Неудача может быть обусловлена качеством реагента, например недостаточной длиной углеводородной цепочки и присутствием в качестве примеси монофункционального производного.

Некоторые олигомерные белки не образуют гибридных молекул по неизвестной причине [82], правда, в отдельных случаях отсутствие связывания мономеров является отражением неблагоприятной локальной геометрии полипептидной цепи [135]. На основании подобного рода отрицательных результатов не следует делать категорических выводов [ 132].

На диссоциацию и сборку олигомерного белка может оказывать влияние рН среды, и этот фактор может быть причиной получения недостаточно четких данных. Замечено [171], что в некоторых случаях конформация мономера может в такой степени зависеть от рН среды, что реакция со сшивающими агентами вообще не идет.

Область применения метода ограничена олигомерами с молекулярной массой не более 500 000, поскольку эта величина является верхним пределом разрешения с помощью электрофореза в ПААГ-ДСН.

1.4.3. Гибридизация

Сведения о субъединичном составе олигомеров могут быть получены по результатам гибридизации in vitro двух различных очищенных форм белка. Это могут быть гомологичные белки, изоферменты или олигомеры, модифицированные химическим путем; важно только, чтобы две формы белка имели какие-либо отличительные признаки, по которым можно было бы различать и определять полученные гибридные молекулы. По количеству образующихся гибридов можно определить число мономеров в олигомере. Например, можно предположить, что при сборке тетрамера из идентичных субъединиц а и (5 могут возникать пять различных комплексов: аааа, аасф, аа?ф,

Если мономеры не идентичны (в частности, аспартаттран-скарбамилаза содержит 6 каталитических и 6 регуляторных субъединиц), задача существенно сложнее. Если субъединицы разные, но в структурном и функциональном отношении эквивалентны, то количество N возможных гибридов определяется следующей формулой:

58

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

(т + s -1)1 s? (от — 1)Г

где 5 — число субъединиц, a m — суммарное число различных типов единиц.

Часто исследователь не располагает гомологичными белками (или изоферментами), необходимыми для гидридизации; поэтому в более общем случае рекомендуется химическая модификация. При исследовании субъединичной структуры аль-долазы модификацию проводили с помощью янтарного ангидрида [120]. В результате положительно заряженные остатки о о сн2—cN сн2—с—он

| /О + NH2—R — |

СН2 —С CH2-C-NH-R ч

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы по иксель
угольный котел отопления
тумба угловая
аренда машин в москве под такси

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)