химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

(может быть, из-за образования циклических ангидридов при активации карбодиимидом), что приводит к повторному образованию исходных аминокислот при гидролизе. Кроме того, до настоящего времени метод применялся по отношению к небольшим пептидам, для которых только и имеет смысл проводить дифференциальный аминокислотный анализ.

18.3 А А. О-Пивалоилгидроксиламин [61]. Гидрохлорид О-пивалоилгидроксил-амина (ОПГА-НС1, 154 мг, 1 ммоль) растворяют в 4 мл воды, доводят рН до 3,5 при помощи 1 М едкого иатра. Добавляют раствор пептида (1 мкмоль) в 2,0 мл воды с последующим немедленным внесением 0,4 мл 0,5 М водного раствора ЭДК; поддерживают (рН-стат) рН 3,5 путем добавления 0,1 М соляной кислоты. С интервалами 15 мин добавляют порциями раствор ЭДК (3 раза по 0,4 мл). Избыток ЭДК и ОПГА-НС1 «гасят» 0,5 мл 5 М формиатного буфера (рН 3,5) при перемешивании в течение 20 мин. Перегруппировка Лоссеня начинается при увеличении рН до 8,5 и температуре 50 °С. рН 8,5 поддерживается в течение 20 ч при помощи 1 М NaOH. Процесс контролируют по расходу щелочи для поддержания рН (рН-стат). Пробу (аликвоту) гидролизуют 6 М НС1 и проводят аминокислотный анализ; С-концевой статок определяют дифференциальным методом.

18.3.5. Определение С-концевых аминокислот путем алкоголиза оксазолов

В основе этого нового метода С-концевого анализа лежит превращение С-концевой аминокислоты в имидоэфир, который в кислых условиях легко расщепляется спиртами [68]. Циклические имидоэфиры образуются в ходе внутримолекулярной дегидратации, происходящей при образовании либо оксазолинона (замыканием С- концевой карбоксильной группы на последнюю пептидную связь), либо оксазола (замыкание сложноэфирной С-концевой группы на последнюю пептидную связь).

Для успешного проведения реакции путь с образованием оксазола является предпочтительным, так как последний в условиях кислотного алкоголиза количественно расщепляется, давая сложный эфир С-концевой аминокислоты. Расщепление оксазолинонов спиртами в кислых условиях дает свободную С-концевую аминокислоту, но главным побочным продуктом является нерасщепленный сложный эфир пептида (рис. 18.8). Метод можно использовать для идентификации С-концевых остатков; в настоящее время предпринимаются попытки разработать на этой основе методику последовательного С-концевого анализа.

32*

nenT4rNH-CH-C-NH-CH-C-0.^Ac-nenTHfl-NH-CH-C=N Ac-nenTMA-NH-<:H-C:-NH-CH-C-0-Me

О О Ж о' ЬУеОН'Уг 0 0 w гидрид п--\ эфир пептида _

пептид оксазолиион Ас-пепгиД-МН-СН-С^-Ме+МНгСН-(?-ОН

ортозфир укороченного пепти с-конц,евая амино-да кислота

nenTW-NH-CH-C-NH4:H-C-0-Et-^nenw-NH-CH-C=N '^^WnA-NH-CH-C-O-Me+NH-CH-C-O-Et 0 0 0^ ^CH-Rn O-Me 6

С \-__/ N_/

Et

эфир пептида оксазол

л ортоэфир укороченного леп- эфир С-концевой

и тида аминокислоты

РИС. 18.8. Реакции, происходящие при С-концевом анализе с алкоголизом оксазолинона или оксазола. Катализируемый кислотой алкоголиз может проходить по двум направлениям, что приводит к образованию нерас-щепляемого сложного эфира пептида и С-концевой аминокислоты. Катализируемый кислотой алкоголиз соответствующего оксазола не имеет этого недостатка и приводит к получению сложного эфира С-концевой аминокислоты [681.

18.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

501

. пептцц - NH- CH- C-NH-CH- С- ОН О О пептид

уксус-гидрид

Ac-nenTMA-NH-CH-O-NH-CH-C-O-C-CHj—Ac-nenTMfl-NH-CH-CFN

о оо Оч сн-

.Ас-пепгид-NH-CH-C-OH

и

О

/короченный пептид

HN-CH

> I ,W

S=C-NH

тиогидантоин

Rn-1 Rn Ас- пепти д-NH - СН- С- N -СН

оксазолинон

,С=СГ

S=C-NH

пептидилтио-гид а н той н

Ас-пептид-NH-CH-C-NH-CH

смешанный ангидрид изо-тиоциановой кислоты

РИС. 18.9. Расщепление пептидов и белков при помощи тиоцианата [83].

18.4. Определение С-концевой последовательности

Пока не существует методов определения протяженных последовательностей С-концевых аминокислот. Применяемые химические и ферментативные подходы позволяют определить последовательность лишь нескольких остатков. В большинстве случаев для получения информации в основном используются карбоксипептидазы, несмотря на присущие этому методу недостатки: разные скорости отщепления различных аминокислот и трудности соблюдения тщательно контролируемых условий последовательного отщепления. Вопросы, связанные с использованием карбоксипептидаз, обсуждаются в разд. 18.4.4.

18.4.1. Расщепление при помощи тиоцианата

Среди всех химических подходов этот метод является наиболее исследованным [83]. Позднее он был модифицирован с целью улучшения условий проведения реакций в растворе [18, 48, 84, 97] и па твердой фазе [71, 94]. Однако каждый из предложенных вариантов позволял определять последовательность лишь нескольких С-концевых аминокислот.

Пептид (белок) выдерживают с тиоацетатом аммония в растворе уксусной кислоты и уксусного ангидрида для образования пептидилизотиоцианата, который спонтанно^перегруппировывается в пептидилтиогидантоин (рис. 18.9). Последний избирательно расщепляют кислотой или щелочью; при этом получаются тиогидантоин С-концевой аминокислоты и укороченный пептид (белок) с новым С-концевым остатком.

В основу этого метода определения С-концевой последовательности положены результаты работы [41] по превращению ациламинокислот в тиогидантоины при помощи тиоцианата аммония и уксусного ангидрида. Позднее [76] к этой реакции до-

502

18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

бавилась стадия отщепления (1 М едкий натр, 3 ч, комнатная температура), что позволило перейти к повторяющемуся образованию и отщеплению тиогидантоинов аминокислот, т. е. к анализу С-концевой последовательности полипептидов. Последняя методика с ограниченным успехом применялась для определения концевых групп ряда пептидов и белков [29]. Пересмотр условий образования и отщепления тиогидантоинов привел к появлению методики определения аминокислотной последовательности пептидов в более мягких условиях [83]. По такой же схеме можно определять и С-концевую последовательность белков [18]. Однако при указанных условиях не отщепляются Asp и Pro (Asp образует циклический ангидрид, не реагирующий с тиоцианатом аммония); это ограничение можно обойти, модифицируя обе карбоксильные группы Asp карбодиимидом [35] и снимая фер-ментативно защитную группу с а-карбоксила [44]).

Другие модификации включают использование ТФУ и аце-тилхлорида вместо уксусного ангидрида [48], для того чтобы реакция проходила главным образом через образование смешанного ангидрида, а не оксазолинона [98]. Кроме того, предполагалось использовать в реакции не тиоцианаты, а саму тиоциановую кислоту [48]. В этих условиях удалось провести успешное определение аминокислотной последовательности пептидов, в том числе имевших С-концевой Pro. Проведение реакции с добавлением трифтороуксусного ангидрида [96] позволило определить 14 аминокислот папаина и 10 аминокислот рибо-нуклеазы [97].

При проведении процесса в растворе для отделения избытка реагентов от пептидилтиогидантоина и тиогидантоина от укороченного пептида обычно используют хроматографию на сефадексе. Эти разделения и лиофилизация фракций с колонки отнимают много времени. Твердофазный анализ исключает многие из этих проблем, но неудачный выбор (или предварительный синтез) активированного носителя и сложности присоединения пептида к носителю резко снижают шансы на успех определения. Ниже приводится детальное описание методик.

18АЛ.1. Расщепление пептидов тиоцианатом.

Образование пептидилтиогидантоинов. Методика 1 [83]. Растворяют пептид в 0,5 мл 50%-ной уксусной кислоты. К раствору пептида при перемешивании медленно добавляют свежий раствор тиоцианата аммония (100 мг), уксусного ангидрида (4,0 мл) и ледяной уксусной кислоты (1,0 мл). Нагревают при 50°С в течение 6 ч, добавляют при перемешивании еще 100 мг тиоцианата аммония, нагревают реакционную массу при 50 °С еще 18 ч. Затем добавляют воду (3,0 мл) оставляют раствор стоять в течение нескольких минут для гидролиза избытка уксусного ангидрида.

Методика 2 [87]. Пептид обрабатывают 1,0 мл ацетилирующей смеси: уксусная кислота — уксусный ангидрид — пиридин (2-10:1) при 50 °С в течение 30 мин, затем добавляют 1,0 мл раствора тиоцианата аммония

18.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

в уксусной кислоте (20 мг/мл), нагревают реакционную массу при 50 °С при интенсивном перемешивании в течение 30 мин.

Методика 3 [48]. Растворяют пептид в смеси ТФУ (10 мкл) и ацетил-хлорида (200 мкл), инкубируют реакционную смесь при 30 °С в течение 15 мин. Добавляют раствор 3%-ной роданистоводородной кислоты в диоксане (200 мкл) и выдерживают реакционную смесь при 30 °С еще 60 мин. После образования пептидилтиогидантоина растворитель можно удалить в вакууме.

Выделение пептидилтиогидантоина.

Методика 1 [83]. Пептидилтиогидантоин отделяют от избытка реагентов •обессоливанием на колонке с сефадексом G-25 (20X500 мм) в 50%-ной уксусной кислоте. Собирают фракции по 5 мл, детектируя пептидилтиогидантоин по УФ-поглощению; нужные фракции объединяют.

Методика 2 [87]. Выделение проводят без хроматографического разделения. Отщепление проводят прямо в реакционной смеси после упаривания «ее досуха.

Расщепление пептидилтиогидантоинов.

Методика 1 [83]. Объединяют фракции, содержащие пептидилтиогидантоин; растворитель упаривают в вакууме. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл 0,1 М ацетогидроксамовой кислоты в 50%-ном пиридине. Нагревают раствор при 50 °С в течение 2 ч, упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 3 мл 50%-ной уксусной кислоты, отщепленный тиогидантоин С-концевой аминокислоты отделяют от укороченного пептида хроматографией на колонке с сефадексом G-25 (20x500 мм).

Методика 2 [87]. Раствор без разделения упаривают досуха. Остаток растворяют в воде (3 мл), отщепляют тиогидантоин, для чего в реакционную смесь добавляют 2 г катионита (дауэкс 50 WX8) и перемешивают при 50 СС в течение 30 мин.

Методика 3 [48]. Отщепляют тиогидантоин 0,5 М триэтиламином.

18.4.1.2. Расщепление белков при помощи тиоцианата. Поскольку белки плохо растворимы в смеси уксусная кислота — уксусный ангидрид, было предложено использовать тригидрат гексафтороацетона [18] и трифтороуксусный ангидрид [96].

Образование тиогидантоина белка.

Методика 1 [18]. Белок (0,015—1,0 мкм) растворяют в смеси тригидра-та гексафтороацетона (1,0 мл) и воды (0,35 мл). По каплям при перемешивании добавляют свежеприготовленный прозрачный раствор тиоцианата аммония (100 мг) в смеси тригидрата гексафтороацетона (1,0 мл) и уксусного ангидрида (4,5 мл).

Смесь нагревают при 50 °С в течение 2 ч, затем добавляют еще 100 мг тиоцианата аммония и нагревают еще 18 ч. Для разрушения избытка уксусного ангидрида добавляют воду (3,0 мл). Тиогидантоин белка отделяют от побочных продуктов на сефадексе G-25.

Расщепление тиогидантоина белка.

Методика 1 [18]. Объединяют фракции элюата, содержащие тиогидантоин белка; растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1,0 мл 12 М НС1 и оставляют при комнатной температуре на 30, мин. Соляную кислоту удаляют путем быстрого упаривания в вакууме. Остаток растворяют в 50%-ной уксусной кислоте, отщепленный тиогидантоин отделяют от укороченного белка гель-фильтрацией, как описано выше. Растворитель немедленно упаривают, добавляют небольшой объем метанола и без промедления (так как тиогидантоины неустойчивы на свету и на воздухе) идентифицируют тиогидантоин методом ТСХ.

18.4.1.3. Идентификация тиогидантоинов. После отщепления тиогидантоинов от небольших пептидов можно проводить аминокислотный анализ укороченного пептида и определять С-концевую аминокислоту по разности аминокислотного состава пептидов до и после отщепления. Для белков следует про-

504 18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

старт KM-Cys Тут

-е направление Leo ^ S«r А ф H,S • ¦ Lys Asp •

см • # KM-''ys Ayi • KM - Cys

старт 1-е направление старт

РИС. 18.10. Двумерная ТСХ тиогидантоинов аминокислот на полиамиде (пластинки 100x100 мм). Хроматография в первом направлении: ледяная уксусная кислота — вода (7:13); во втором направлении: смесь хлороформ — 95%-ный этанол — ледяная уксусная кислота (20:20:3), содержащая флуоресцентный индикатор 2,5-бис(5-грег-бутил-бензоксазолил-2)тиофсн (0,025%). При УФ-освещении (254 нм) тиогидантоины проявляются в виде темных пятен на флуоресцирующем бледно-голубом фоне [70].

водить прямую идентификацию отщепленных тиогидантоинов, например при помощи ТСХ на силикагельных пластинках, пропитанных флуоресцирующим индикатором. Хроматографию проводят либо в системе гептан-к-бутанол — 99%-ная муравьиная кислота (95:65:30), либо в системе хлороформ — 95%-ный этанол — ледяная уксусная кислота (100:50:15) [18, 83, 84].

Более эффективна двумерная ТСХ на полиамидных пластинках (ЮОХ Х100 мм) в среде уксусная кислота — вода (7:13) в первом направлении и хлороформ — 95%-ный этанол — ледяная уксусная кислота (20:10:3), содержащая 0,025% 2,5-бис(5-трвг-бутилбензоксазолил-2)тиофен, во втором направлении [70]. При УФ-облучении (254 нм) тиогидантоины аминокислот проявляются в виде темных пятен на бледно-голубом флуоресцирующем фоне (рис. 18.10).

Тиогидантоины аминокислот можно идентифицировать методом ГЖХ после их триметилсилилирования [23» 72], методом масс-спектрометрии [19, 72, 86, 87], а также после гидролиза тиогидантоинов до свободных аминокислот методами ионообменной хроматографии [84] и ГЖХ [70].

18.4.2. Расщепление при помощи цианамида

Предложена новая методика С-концевого последовательного расщепления белков (пептидов) [88], обладающего очевидными преимуществами по сравнению с тиоцианатным расщеплением

18.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

650

<лептид-[\|Н-(пептид")

Г"

-сн-

in )п"1 *п

¦C-NH-CH-C-0H ^1 пептид-NH-CH-C-NH-CH

II 50 С м \

Rn-i

H5%nenTHA-NH-CH-C-NH-CH

H2N-C-NH2 S

(сн2)3

иодид /f-бутилтиурония

HN=C-NH

l

s

пептидилизотиомочевина

N^C-Г пептидилцианамид

:c=o

пептид-NH-CH-C-OH + NH—CH

6 | )>0

HN=C-NH

С укороченный Симиногидантоин} пептид}

РИС. 18.11. Цианамидное расщепление [88].

{рис. 18.11). На первой стадии проводят при помощи карбодиимида конденсацию пептида с S-алкилтиурониевой солью, затем производное С-концевой аминокислоты отщепляют в водной среде при рН 104-11,5. Реакция отщепления проходит в две четко различимые стадии. Алкильная часть ацилированной изо-тиомочевины удаляется при обработке основанием, давая ацил-цианамид. Цианогруппа подвергается нуклеофильной атаке атомом азота пептидной связи. Затем происходят циклизация и отщепление иминогидантоина от укороченного пептида. Ими-ногидантоины — довольно полярные соединения и в целом проявляют хроматографические свойства исходных аминокислот. Их можно детектировать после ТСХ опрыскиванием пластинок раствором нитропруссида — феррицианида или ГЖХ триметилсилилированных производных [88].

Было найдено, что иодид S-tt-бутилтиурония — наиболее ре-акционноспособный из всех изученных солей изотиурония. При взаимодействии пептида с этим реагентом

страница 78
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
подготовить перетяжку к печати
купить караоке для дома недорого
Wirbel EKO CKB Plus 25_new
концерт кристины орабакайте в декабре 2016

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)