химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ие С-концевого остатка, введя поправку, учитывающую отношение включения трития в искомую и в стандартную С-концевые аминокислоты, определяемого и стандартного белков (табл. 18.2). Существуют и неразрешенные еще проблемы; так, не обнаруживается Pro, а определение Ser и Thr приводит к невоспроизводимым результатам; при наличии Gly в предпоследнем положении может снижаться содержание метки в С-концевой аминокислоте.

18.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВЫХ ГРУПП

493

Таблица 18.2. Сравнительные коэффициенты включения трития в различные ацетиламинокислоты (относительно меченого ацетилаланина)8

Аминокислота Коэффициенты Аминокислота Коэффициенты

Lys 1,52 Gly 0,68

His 0,61 Ala 1,00

Arg 1,96 Val 0,93

Asp 0,32 Met 2,32

Asn 2,30 He 1,18

Thr 0,09 Leu 2,27

Gin 0,82 Tyr 1,95

Glu 1,16 Phe 2,01

Навеску каждой N-ацетиламинокислоты метили тритием в присутствии известного количества N-ацетилаланина. После кислотного гидролиза и разделения аминокислот измеряли отношение удельной радиоактивности изучаемой С-концевой аминокислоты и внутреннего стандарта (Ala). Радиоактивность Ala принята за 1,00 [571.

18.3.2. Гидразинолиз

Гидразинолиз впервые был использован в 1952 г. для определения С-концевых аминокислот; однако на практике этот простой метод часто приводит к неудовлетворительным результатам даже при введении большого числа поправок [1, 2, 11 —13, 45, 46, 62, 65, 66].

При нагревании белка (пептида) с гидразином пептидные связи разрываются, карбонильная группа пептидной связи образует гидразид. В виде свободной кислоты остается только С-концевая (рис. 18.5). Эту' аминокислоту отделяют от всех гидразидов и идентифицируют.

Исходную методику неоднократно модифицировали путем изменения условий проведения реакции, метода отделения гидразидов от свободной кислоты или метода определения и количественного анализа С-концевой аминокислоты.

Первоначально методика включала нагревание белка с гидразином при 100 °С в течение 10 ч [1]. При этих условиях цистин и цистеин (но не цистеиновая кислота, 5-карбоксиметил-цистеин или S-аминоэтилцистеин) полностью разрушаются [11]; Arg разрушается и частично превращается в Огп и гуани-дии [65]. Многие другие остатки частично разрушаются из-за высокой температуры реакции [11, 12]. Сообщалось, что добавление кислого катализатора (сульфат гидразина) к безводному гидразину позволяет проводить реакцию в гораздо более мягких условиях (60—80 °С) [46]; при этом повышается выход С-концевых аминокислот. Для улучшения выхода использовали Н+-форму ионообменной смолы амберлит CG-50 [12]. Показано, что скорости отщепления различных С-концевых аминокислот, а так-

494 18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Rn-2 Rn

I I I

пептид —NH—СН—С—NH—СН—С—NH—СН—С—ОН

II II II

ООО

безводный

H2N—NHj

R»-2 R„-l Rn

.....+ NH2—СН—C—NH—NH2 + NH2—CH-C—NH—NH2 + NH2—CH-C—OH

II II II

ООО

N___/ \_/

смесь г идрэзидов аминокислот С^концевэя

аминокислота

рис. 18.5. Гидразинолиз пептида с освобождением с-концевой аминокислоты.

же устойчивость аминокислот в условиях гидразинолиза неодинаковы. Поэтому невозможно дать каких-либо рекомендаций^ касающихся продолжительности проведения реакции, что обычно очень желательно. Поэтому следует провести серию опытов^ изменяя время нагревания.

Отделение свободных С-концевых аминокислот от смеси гидразидов аминокислот следует проводить быстро, так как гидразиды малоустойчивы и в присутствии воды легко превращаются в свободные аминокислоты. Чувствительность определения зависит от метода разделения и чувствительности детектора. В первоначальном варианте к водному раствору гидразидов аминокислот добавляли свежеперегнанный бензальдегид, который превращал гидразиды аминокислот в маслянистые дибен-зали, легко отделяемые от свободных аминокислот путем центрифугирования [1]. Однако при однократной обработке бензаль-дегидом гидразиды аминокислот отделялись не полностью. Изменение методики и использование изоамилового альдегида [2], энантового (гептилового) альдегида [9], а также /г-нитро-бензальдегида [66] не дали заметного улучшения. Гидразиноли-зат обрабатывали 2,4-динитрофторобензолом (ДНФ), что привело к образованию нейтральных ди- и три-ДНФ-производных, которые легко отделяются от кислой моно-ДНФ-С-концевой аминокислоты путем экстракции этилацетатом и диэтиловым эфиром [46]. Кислые ДНФ-производные идентифицировали методом двумерной бумажной хроматографии [53]. Можно обрабатывать гидразиды сначала бензальдегидом, потом ДНФ-бен-золом, а затем уже проводить экстракцию [65]. С-Концевую ДНФ-аминокислоту определяли методом бумажной хроматографии.

Как указывалось в одной из работ [7], многие из этих сложных модификаций были предложены до появления современных методов аминокислотного анализа и в настоящее время устарели. Хотя гидразинолизат после удаления избытка гидразина

18.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВЫХ ГРУПП

495

можно нанести прямо на колонку аминокислотного анализатора, этого не рекомендуется делать, так как гидразиды очень трудно удалить с колонки и для регенерации смолы может потребоваться до пяти объемов обычных промывок едким натром. Предпочтительнее отделить гидразиды от свободной С-концевой аминокислоты, пропустив раствор через колонку с катионитом, например фосфоцеллюлозой или амберлитом IR-120, как описано ниже.

18.3.2.1. Методика гидразинолиза [12].

Получение безводного гидразина. Гидразин перегоняют над гидроксидом натрия под азотом в обычном стеклянном перегонном аппарате. В 250 мл круглодонную колбу помещают 100 мл «безводного» (продажного) гидразина (95%-ный) и 40 г гидроксида натрия, продувают прибор сухим азогом, пропущенным через концентрированную серную кислоту. Гидразин нагревают под азотом при атмосферном давлении до температуры кипения, затем охлаждают до комнатной температуры. Гидразин перегоняют в вакууме (масляный насос), в потоке азота, подаваемого через капилляр, собирая фракцию, кипящую при 16—18 °С в 100-миллиметровую круглодонную колбу-приемник, охлаждаемую сухим льдом. Перегнанный гидразин хранят в закрытой колбе над пентоксидом фосфора при 2 °С или лучше в запаянных ампулах (порциями по 5 мл). Гидразин быстро поглощает влагу воздуха и становится непригодным для проведения гидразинолиза.

Реакция гидразинолиза. Смолу (амберлит CG-50, <200 меш) промывают последовательно 1 М едким натром, водой, 2 М соляной кислотой, затем вновь водой до отрицательной реакции на хлорид-ионы. Смолу сушат в печи при 80 °С и хранят в вакуум-эксикаторе над пентоксидом фосфора.

Сухой амберлит CG-50 (50 мг) помещают в толстостенную пробирку из пирекса (15X125 мм). Добавляют лиофилизированный белок (~250 нмоль), на уровне верхней трети высоты пробирки делают перетяжку и вносят гидразин (2 мл), который втягивается внутрь пробирки через узкую перетяжку после охлаждения нижней части пробирки в спирте с сухим льдом. Важно исключить поглощение углекислого газа воздуха гидразином, так как это ведет к появлению большого количества нингидрин-положительного материала, который мешает при последующей хроматографии. Замороженный образец запаивают в вакууме, помещают в термостат при 80 °С на 10—100 ч. Во время гидразинолиза надо мягко встряхивать образец (3—4 раза в день). Если по каким-то причинам образец нельзя анализировать сразу после проведения гидразинолиза, раствор можно хранить, не вскрывая ампулы, при —20 °С.

После гидразинолиза реакционную смесь переносят в сухую круглодонную колбу на 25 мл, принимая меры для предотвращения попадания влаги воздуха. При возможности работу следует проводить в сухой камере. Пробирку ополаскивают гидразином (2 раза по 1 мл) и объединенный раствор лиофилизируют; через 3 ч гидразин полностью удаляется из замороженной смеси.

Хромат о графическое отделение гидразидов от отщепленной С-концевой аминокислоты. В оригинальной методике [12] для хроматографического отделения свободной С-концевой аминокислоты от гидразидов аминокислот использовали три катионообменные смолы (амберлит IR-120, амберлит CG-50 и фосфоцеллюлозу). Для хроматографии на амберлите IR-120 необходимы два летучих буфера (рН 3,1 и 5,2) и колонка, термостатированная при 30 °С; время анализа составляет ^8 ч. Хроматография на фосфоцеллю-лозе экспериментально проще, требует только 4 ч, происходит в одном буфере при комнатной температуре; при этом удается за один рабочий цикл отделить все аминокислоты, а также моногидразиды Asp и Glu. Однако фос-

496

18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

СООН

CONH.NH, I

(СН2), 2

(СН2)

lh -2

NH2—СН—CONHNHi

NH2—СН—СООН

гид разил. С-концевого амида

гидразид внутреннего остатка кислоты

РИС. 18.6. Структура гидразидов внутренних остатков Asp и Glu и С-концевых Asn и Gin.

фоцеллюлоза имеет меньшую емкость и на колонку размером 10x300 мм нельзя загружать >10 мг белка. Применение амберлита CG-50 не дает никаких преимуществ. Фракционирование с применением фосфоцеллюлозы описано ниже.

Непосредственно перед разделением лиофилизат, содержащий гидразиды, свободные аминокислоты и смолу-катализатор, суспендируют в 3,0 мл воды, центрифугируют, смолу дважды промывают 1 мл воды. Маточный раствор и промывки (рН 8,5—9,0) объединяют; добавляют несколько капель 2 М соляной кислоты до рН 2. Наносят раствор на колонку с фосфоцеллюлозой (10X300 мм, фирма Whatman, марка Р-70, нефракционированная), уравновешивают 0,4 М пиридин-формиатным буфером (рН 3,2; 32,2 мл пиридина + 47 мл 98%-ной муравьиной кислоты, доводят объем водой до 1 л), хрома-тографируют при комнатной температуре в буфере рН 3,2 при скорости потока 30 мл/ч. Собирают фракции по 2 мл, проверяют их нингидрином на наличие аминокислот. Кислые и нейтральные аминокислоты элюируются в объеме между 20 и 37 мл элюата, Lys, аммиак, моногидразиды Asp и Glu — между 42 и 75 мл, His — между 80 и 90 мл, Arg — между 93 и 112 мл. Гидразиды аминокислот прочно удерживаются на колонке, поэтому ее используют лишь один раз. Соответствующие фракции объединяют, сушат и анализируют. Перед определением Asp и Glu следует гидролизовать их моногидразиды.

Заключительный комментарий. Из-за различия как в скорости отщепления, так и в устойчивости С-концевых аминокислот невозможно дать конкретные рекомендации относительно продолжительности проведения реакции гидразинолиза. Лучше всего анализировать серию образцов, нагревая их при 100°С в течение 10—100 ч. Методика позволяет проводить количественное определение всех С-коицевых аминокислот, за исключением Arg, Asn, Gin и, возможно, Lys. При гидразинолизе С-концевые Asn и Gin выщепляются в виде моногидразидов (замещение по амидным группам боковых цепей). Эти моногидразиды по строению и хроматографическим свойствам очень похожи на моногидразиды, получающиеся из внутренних остатков Asp и Glu (рис. 18.6). Их определение затрудняется из-за того, что по некоторым сведениям оба моногидразида Asp могут взаимно превращаться друг в друга [62].

18.3.3. Селективное восстановление

Химическое восстановление С-концевой аминокислоты в соответствующий спирт было первой химической реакцией, использованной для определения С-концевой аминокислоты белков. Например, инсулин нагревали с LiAlH4 в N-этилморфолине при 55 °С в течение 8 ч и определяли полученные аминоспирты методом хроматографии на бумаге [26]. Реакцию восстановления

18.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВЫХ ГРУПП

497

проводили также после предварительной этерификации всех карбоксильных групп белка [17]. При этом использовали мягкий восстанавливающий агент LiBH4 в тетрагидрофуране, затем количественно определяли аминоспирты, полученные из С-концевых аминокислот. Наряду с основными процессами происходит восстановительное расщепление пептидных связей (1—2%) и перевод пептидных карбонилов в метиленовые группы.

Для восстановления С-концевых аминокислот ди- и трипеп-тидов использовали коммерчески доступный дигидробис(2-мето-ксиэтокси) алюминат натрия [75]. Метод позволяет исключить предварительную этерификацию карбоксильных групп. Аминоспирты идентифицировали бумажной хроматографией. До сих пор неизвестно о применении этого способа восстановления для определения С-концевых аминокислот белков. Сообщалось, что NaBH4 в водном растворе (но не в органическом растворителе) селективно и почти количественно восстанавливает этерифици-рованные С-концевые аминокислоты в соответствующие спирты [32]. При работе с лизоцимом, инсулином быка, конканавалином А были получены ожидаемые производные, при этом не было обнаружено побочных процессов. Этот подход может быть доведен до практической методики С-концевого анализа белков, хотя дальнейшее развитие событий во многом зависит от степени надежности аналитического определения аминоспиртов, получающихся из всех обычных аминокислот.

18.3.4. Определение С-концевых аминокислот в виде альдегидов

О-Пивалоилгидроксиламин количественно реагирует с активированными карбодиимидом карбоксилсодержащими кислотами, образуя О-пивалоилпептидогидроксаматы (рис. 18.7) [61]. Ионизация гидроксаматнон связи N-H (рКа 6,7—7,4) инициирует в пептидах перегруппировку Лоссеня, приводящую к образованию пептидилизоцианата, который в свою очередь превращается в смесь пептидилмочевин. Из раствора отбирают аликво-ту, гидролизуют 6 М соляной кислотой, определяют С-концевую аминокислоту дифференциальным методом; при этом С-концевая аминокислота превращается в альдегид. Альдегид можно получить и другим путем: доводят рН до 1—2 и нагревают реакционную смесь в течение 2 ч при 50 °С.

Эту методику успешно применяли для определения С-концевых аминокислот восемнадцати ди-, три-, тетра- и пентапеп-тидов, а также А- и В-цепей инсулина. При этом С-концевую аминокислоту определяли дифференциальным методом, хотя в некоторых случаях альдегид количественно определяли методом хроматографии на бумаге в виде 2,4-динитрофенилгидразона.

32—703

пептид-NH-CH-C-NH-CH-C-OH ^ъ$ж^пептид-NH-CH-C-NH-CH-G-0~Cn

О

пептид

кэрбодиимид

II о

II О

NHR

пептид-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-0-C-C-(CH1)4

и и и У3

ООО О-пивалоилпептидогидроксамат

пептид-NH-CH-C-OH -f СН

и О

укороченный пептид

п РН1-2 О 5(ГС альдегид

п-1

пептид-NH-CH-C-NH п

о

-CH-NH-C-

л

О

'п-1

I перегруппировка lЛоссеня

N Н2*^пептид- NH - СН- С-МН - СН- N-C- О

7ПН

пептид-NH-CH-

смесь мочевин R

R.

П-1

NH-CH-NH

К оо

пептид-NH- СН- С- NH - СН - NH

-nenTH?-NH-CH-<;-NH-CH-NH2 6

амищ аминокислоты

РИС. 18.7. Реакции, происходящие при С-концевом анализе с образованием альдегида. О-Пивалоилгидроксил-амин количественно реагирует с С-концевой аминокислотой, активированной карбодиимидом, образуя гид-роксамат. Ионизация связи N—Н гидроксамата инициирует перегруппировку Лоссеня с последующим превращением С-концевой аминокислоты в альдегид [61].

18.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОИЦЕВЫХ ГРУПП

499

К достоинствам описанного метода можно отнести возможность использования водных растворов (и при необходимости мочевины), высокие выходы (для большинства аминокислот 70—100%) и успешное определение С-концевых Pro, Asn и, возможно, Gin. Однако для Asp и Glu наблюдаются низкие выходы

страница 77
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
краснодар обучение установка кондиционеров
световые доски в автомобиль
купить обувницу металлическую
билеты на мэрилин мэнсон

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)