химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

1 М соляную кислоту) [21]. При перемешивании добавляют карбодиимид (ЭДК, 15 мг, 80 мкмоль), поддерживают рН 4,7 в течение 6 ч.

Ферментативное расщепление. Термолитическое расщепление проводят в 1%-ном водном бикарбонате аммония при 37 °С в течение 8 ч при соотношении фермент : субстрат^ 1 : 35 (по массе). Для прерывания расщепления реакционную смесь лиофилизуют.

Выделение пептидов путем электрофореза. Смесь пептидов растворяют в буфере пиридин — уксусная кислота — вода (6:10:1200, рН 4,4), наносят полосой в 330 мм на хроматографическую бумагу ватман 3 ММ вместе с маркерами (амид Ala и таурин, 5 нмоль/мм) и подвергают электрофорезу при рН 4,4 в течение 60 мин при напряжении 6 В/мм; бумагу высушивают. Для проведения аналитического опыта вырезают полосу, содержащую пептиды, пришивают ее к целому листу бумаги ватман 3 ММ и проводят ЭФ при рН 2,1 (муравьиная кислота — уксусная кислота — вода, 1:4:45) в течение 40 мин при 6 В/мм. Элсктрофореграмму окрашивают Cd-нингидриновым раствором (разд. 8.14.2). На электрофореграмме, приведенной на рис. 18.2, видно, что на диагонали, ограниченной маркерами, находятся два пептида. (В препаративном опыте после проведения ЭФ при рН 4,4 можно вырезать область на диагонали, содержащую два пептида, и привести ЭФ при рН 2,1.) Пептиды, движущиеся медленнее других и соответствующие двум «диагональным» пептидам, вырезают и при необходимости дополнительно очищают ЭФ при рН 2,1 или 6,5.

Эту методику недавно использовали для определения положения расщепления молекулы гемагглютинина вируса гриппа протеолитическим ферментом бромелаином при ферментативном отщеплении белка от поверхности вируса [21].

Предполагается, что этот метод должен стать широко распространенным [22]. Все пептиды, полученные из С-концевой области белка, располагаются на диагонали независимо от их аминокислотной последовательности. При гидролизе можно использовать любой фермент при условии, что в гидролиза-те окажутся пептиды достаточной длины, а определение последовательности

18.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВЫХ ГРУПП

487

РИС. 18.2. Избирательное выделение С-концевых пептидов термолитическою гидролизата ос- и р-цепей гемоглобина человека. Гидролизат разделяли электрофорезом при рН 4,4 в первом направлении и при рН 2,1 — во втором [21].

выделенного пептида можно проводить с помощью известных (стандартных) методов.

Наличие этаноламина на карбоксильном конце выделенного пептида гарантирует принадлежность этого пептида карбоксильному концу белка. Возможные невысокие выходы присоединения этаноламина к белку не являются серьезным ограничением метода, так как любой неамидированный пептид после ЭФ оказывается смещенным с диагонали и поэтому не мешает определению искомого фрагмента. Наконец, метод должен оказаться применимым к белкам, имеющим природную амидированную С-концевую аминокислоту, так как подобные белки содержат блокирующую группу того же типа, что и при искусственном амидировании.

18.3. Определение С-концевых групп

С-концевые аминокислоты пептидов или белков можно определить при помощи химических или ферментативных методов. Химические методы включают гидразинолиз, селективное введение трития, избирательное восстановление, образование альдегидов, алкоголиз оксазолов в кислой среде, тиоцианатное или пианамидное расщепление. При ферментативном определении используют карбоксипептидазы. Этот подход в последние годы

488

18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

получил более широкое применение благодаря увеличению числа коммерчески доступных ферментов микробного или растительного происхождения, которые к тому же имеют более широкую специфичность, чем ферменты поджелудочной железы. Расщепление под действием карбоксипептидазы, а также химическими методами обычно дает информацию о С-концевом остатке и С-концевой последовательности аминокислот. Новичкам настоятельно рекомендуется использовать ферментативные методы, если доступна высокочувствительная система детекции. Описана методика ВЭЖХ производных аминокислот с предко-лоночной модификацией аминокислот при помощи о-фталевого диальдегида (ОФА), что позволяет проводить высокочувствительный количественный С-концевой анализ [42].

18.3.1. Селективное введение трития

Среди химических методов определения С-концевих аминокислот к простейшим относится селективное введение трития. Этот метод обладает высокой чувствительностью, проводится с использованием легко доступных реагентов, при очень мягких условиях. После введения тритиевой метки избыточные атомы 3Т удаляются путем повторения чередующихся операций добавления—упаривания воды. Затем проводят гидролиз 6 М соляной кислотой (метансульфоновой кислотой, если предполагается определение Тгр [78]); далее аминокислоты разделяют обычными методами пептидного картирования и определяют радиоактивность в жидкостном сцинтилляционном счетчике. Первоначально этот метод был качественным [57], однако п настоящее время возможно количественное определение трития.

Селективное введение трития включает три последовательные реакции (рис. 18.3). В основе методики лежит различие в химической активности карбоксилов С-концевой аминокислоты и боковых цепей. С-Копцевой карбоксил уникален, так как его можно активировать путем образования оксазолинона (внутримолекулярное взаимодействие с соседней по цепи пептидной связью, происходящее с выделением воды) [69]. Эта реакция проходит при участии уксусного ангидрида. Образующийся при этом оксазолинон содержит активный атом водорода, который легко замещается на тритий при обработке 3Н20 в присутствии пиридина. Оксазолинон претерпевает катализируемую основанием рацемизацию, сопровождаемую гидролитическим раскрытием кольца и регенерацией С-концевой аминокислоты, содержащей атом трития при сх-углероде.

Установлено, что водородно-тритиевый обмен происходит при асимметрическом атоме углерода аминокислоты в условиях рацемизации [58]. Поскольку из пептидного синтеза извест-

18.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВЫХ ГРУПП

489

| n-1 in

пептид. NH-CH-C-NH-CH-C-OH

II ti 0 0

пептид уксусный . ангидрид!

Ac -пептид- NH- CH- C= N _/^-пептид -NH-CH-C=N

оксазолинон |

Ас-пептид—NH-CH-C-NH-C—С-ОН^Ас-пегяид—NH~CH-C=N II zl и т<р n г

0 5h 0 0n^c^ меченый пептид JL-

гидролиз|

^1 ^n-t

Ас-NH-CH-C-OH....+ NH-CH-C-OH + NH2-G*»C-OH II 2 и , Г II

0 0 3H 0

РИС. 18.3. Избирательное введение трития в С-концевую аминокислоту [57}_

но, что процесс рацемизации, происходящий в ходе синтеза, протекает через стадию образования промежуточного оксазо-липоиа С-концевой аминокислоты, то предполагается, что получение таких оксазолипонов химическим путем может оказаться высокоспецифическим методом введения дейтерия (трития) в С-концевые аминокислоты полипептидов [58].

Исследовались три варианта избирательного мечения тритием. Исходная методика [59] включает две стадии: образование оксазолинона при нагревании пептида с карбодиимидом (ди-циклогексилкарбодиимидом, ДЦК) или уксусным ангидридом в безводном диоксане с последующим добавлением одной капли пиридина и 0,5 мл D20 для проведения катализируемой основанием рацемизации с гидролитическим раскрытием кольца. Было найдено, что в указанных условиях аминокислоты подвергались полному дейтерироваиию исключительно по «-углеродному атому.

Контроль дейтериевого обмена осуществляется с помощью ЯМР-спектроскопии; замена D20 на 3Н20 привела к разработке простого и чувствительного метода определения С-концевой аминокислоты.

490 18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Вторая методика была разработана для селективного введения трития в С-концевые остатки Pro и Asp [60]. В вышеуказанных условиях эти аминокислоты не образуют оксазоли-ноны, но дают либо смешанный ангидрид (Pro), либо циклический ангидрид (Asp). При обработке пиридином и 2Н20 эти ангидриды не включают метку, но их можно метить дейтериро-ванной уксусной кислотой. Методика включения метки в Pro и Asp при помощи кислотного катализа была упрощена до одностадийной и заключалась в обработке пептида смесью уксусного ангидрида и 3Н20.

Третий вариант был разработан для белков. Поскольку большинство белков нерастворимо в безводном диоксане, используемом при мечении пептидов, этот растворитель был заменен на смесь водного пиридина, 3Н20 и уксусного ангидрида. В такой системе три реакции проходят в одну стадию (рис. 18.3). Предполагается, что включение метки происходит с образованием промежуточного оксазолинона, находящегося в равновесии с исходным С-концевым пептидом.

При проверке всех трех методик выяснилось, что одностадийная методика с использованием основного катализа, разработанная для белков, дает наилучшие результаты и в случае пептидов [36]. Кроме того, было найдено, что в противоположность исходному двухстадийному варианту с использованием безводных растворителей одностадийный метод позволяет заменять водород на тритий в С-концевом остатке Asp (возможно, из-за того, что Asp не может образовывать циклический ангидрид в водной среде). Подробная методика приведена ниже.

18.3.1.1. Введение трития [60]. Образец (3—20 нмоль), помещенный в маленькую пробирку (13X100 мм), растворяют в 0,05 мл 3Н20 (50 мКи). Добавляют пиридин (0,1 мл) и уксусный ангидрид (0,025 мл), раствор оставляют при комнатной температуре на 3 ч. Растворители удаляют в вакууме при 40 °С. Легко обменивающийся тритий удаляют путем многократных операций добавления — упаривания воды (6X100 мкл). Меченый образец гидролизуют в той же пробирке 6 М соляной кислотой, содержащей 0,004 М тио-гликолевую кислоту (в вакууме, при 108 °С, в течение 24 ч).

Для идентификации меченой С-концевой аминокислоты можно использовать любой вид хроматографии: бумажную, тонкослойную, газожидкостную, ионообменную, ВЭЖХ. Удобно использовать метод двумерного картирования на бумаге ватман 3 ММ, так как при этом можно одновременно анализировать несколько образцов. Сухой гидролизат растворяют в 50 мкл воды, добавляют 2 мкл смеси стандартных аминокислот (~5 нмоль каждой аминокислоты). Проводят высоковольтный электрофорез при рН 1,8 (3000 В, 45 мин). Часть хроматограммы (полоску шириной -— 100 мм), содержащую частично разделенные аминокислоты, пришивают ко второму листу бумаги (200X200 мм) и проводят восходящую хроматографию (~3,5 ч) в системе w-бутанол — уксусная кислота — вода —пиридин (15:3: 12: 10). После проявления нингидрин-коллидиновым реагентом (разд. 8.14.2) вырезают пятна аминокислот и определяют на жидкостном сцинтиляционном счетчике их ра-

18.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВЫХ ГРУПП

491

О

х

электрофорез рН 1,9

РИС. 18.4. Двумерное разделение хроматографией на бумаге смеси аминокислот после избирательного введения трития и гидролиза пептида. Гидролизат и смесь стандартных аминокислот разделяли электрофорезом при рН 1,9 в первом направлении и хроматографией — во втором направлении в системе н-бу-танол — уксусная кислота — вода — пиридин (15:3:12:10).

диоактивность. На рис. 18.4 и в табл. 18.1 приведены результаты, полученные при использовании этой методики для определения С-концевых аминокислот нескольких химотриптических пептидов легкой цепи гем агглютинин а вируса гриппа. Ясно видны соответствующие аминокислоты пептидов С4А, С5, Сб. Радиоактивность включенного в С-концевые аминокислоты трития существенно превышает уровень фона. На рис. 18.4 видно, что разделяются все аминокислоты, кроме Leu/Ile, которые частично перекрываются. Тем не менее и в этом случае возможна идентификация, так как радиоактивность отчетливо распределяется по двум пятнам, как это видно в случае пептида СЗ (табл. 18.1). Благодаря применению различных систем растворителей, по-видимому, можно улучшить разделение [36]. Следует отметить, что во внутренние остатки Glu метка почти не включается, а во внутренние Asp включается в разной степени. Сообщалось, что остатки Asp, входящие в последовательность Asp-Gly (пептид СЗ, табл. 18.1), содержат значительно больше трития, чем другие внутренние остатки Asp (см. пептид С6, табл. 18.1) [41.

При использовании системы пиридин — 3Н20 — уксусный ангидрид (4:2:1) в условиях, изложенных ранее, протекает быстрый катализируемый основанием гидролиз уксусного ангидрида, что приводит к разрушению ангидрида до завершения образования оксазолинона и к снижению выхода реакции. Использование большого избытка уксусного ангидрида не улучшает результаты, так как значительно возрастает температура реакции, что влияет на растворимость белка и происходят нежелательные побочные реакции [14, 38]. При использовании смеси пиридин —3Н20 — уксусный ангидрид (3:1:3) на холоду включение трития в С-концевой остаток Leu лизоцима яичного белка увеличилось в ~20 раз [57].

18.3.1.2. Включение трития в белки [57]. Белок (50—100 нмоль) помещают в небольшую пробирку, добавляют 5 мкл (0,5 мКи) 3Н20 и 10 мкл пиридина. Раствор должен быть прозрачным, в противном случае включение метки

492

18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Таблица 18.1. Избирательное введение трития в некоторые пептиды химотриптического гидролизата легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа3

Аминокислота Радиоактивность (имп./мин)

C3 c4 c5 с.

Lys 218 83 35 72

His 50 26 55 91

Arg 50 24 44 146

Asp 1860 170 58 248

Thr 33 32 22 26

Ser 37 31 30 48

Glu 121 45 41 126

Pro 38 12 5 23

Gly 45 34 36 63

Ala 39 20 22 29

Met 68 117 47 23

He 425 56 50 50

Leu 1782 99 85 47

Tyr 53 73 120 4523

Phe 63 2451 3221 68

нмоль пептида 7 4 6 11

4—11 нмоль пептидов метили и гндролизовали, как описано в разд. 18.3.1.1. Аминокислоты разделяли, как указано в подписи к рис. 18.4. Пептиды имели следующую структуру [92]:

С3 — Lys-Ser-Thr-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Gln-Asp-Gly-Lys-Leu С4 — Asn-Arg-Val-Ile-Glu-Lys-Thr-Asn-Glu-Lys-Phe Сь — His-Gln-Ile-Glu-Lys-Glu-Phe

Ce — Ser-GIu-Val-Glu-Gly-Arg-Ile-Gln-Asp-Leu-Glu-Lys-Tyr.

будет неудовлетворительным. Если суммарный объем раствора окажется больше расчетного, то объемы всех реагентов также следует увеличить так, чтобы сохранить необходимые соотношения. Добавляют при 0°С уксусный ангидрид (10 мкл), закрывают пробирку пленкой парафильм и выдерживают при 0 °С в течение 5 мин, затем при 20 °С еще 15 мин. Проводят при 0°С второе добавление пиридина (20 мл) и уксусного ангидрида (20 мкл). Реакционную смесь оставляют при 0 °С в течение 5 мин, затем при 20 °С еще 1 ч. Избыток уксусного ангидрида разрушают добавлением меченой воды (5 мкл), реакционную массу оставляют при 20 °С на 1 ч. Раствор упаривают досуха, легко обменивающийся тритий удаляют путем повторения чередующихся операций добавления — упаривания (по 100 мкл) 10%-ной уксусной кислоты. Меченый белок гидролизуют 6 М соляной кислотой, идентифицируют аминокислоты и измеряют радиоактивность.

Эта методика включения была использована для количественного определения С-концевых остатков [57]; обнаружено, что степень мечения сильно зависит от природы этой аминокислоты (табл. 18.2). Степень мечения меняется, но можно проводить количественное определен

страница 76
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
кирпич лицевой фасадный м150
монтаж наружной рекламы цена
очиститель optimed
матрас 160х125

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.09.2017)