химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ок [12]. Этот подход уже использовался для клонирования труднодоступных генов интерферонов [5] и антигена гистосов-местимости человека [13].

От редактора. Коммерческий прибор (модель 470А фирмы Applied Biosy-stems) испытывался в процессе микроаналитического определения последовательности. Серийные анализы с использованием 1 нмоль миоглобина после проведения 22 циклов отщепления дали среднее значение начального и по-стадийного выходов 24,7±4,9% и 96,1 ±1,9%, (п=5) [3]. Фирма Applied Biosystems регулярно выпускает Users Bulletin, содержащий много полезной' информации о всех аспектах анализа аминокислотной последовательности белка.

Литература

1. Brandt W. Е.л Henschen A., Holt С. vom, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.,

361, 943—952 (1980). 2 Edman P., Begg G., Eur. J. Biochem., 1, 80—91 (1967).

3. Esch F. S.t Anal. Biochem., 136, 39—47 (1984).

4. Hewick R. Af., Hunkapiller M. W.t Hood L. E., Dreyer W. /., J. Biol. Chem.,. 256, 7990—7997 (1981).

480

17. АНАЛИЗ НА МИКРОУРОВНЕ

5. Houghton М.3 Eaton М. A. W„ Stewart A. G., Smith J. С, Doel S. M.f Cat-tin G. H{., Lewis H. M., Patel J. P., Entage Л S., Carey N. H.t Porter A. G., Nucleic Acids Res., 8, 2885—2890 (1980).

6. Hunkapiller M. W., Hood L. Biochemistry, 17, 2124—2133 (1978).

7. Hunkapiller Af. W., Hood L. E.t Science, 207, 523—525 (1980).

8. Hunkapiller Al W., Hewick R. M., Dreyer W. Hood L. E.t Methods Enzymol., 91, 399—413 (1983).

9. Klapper D. G., Wilde C. ?., ///, Capra J. D., Anal. Biochem., 85, 126—131 (1978).

10. Laemmti U. A., Nature (Lond.), 227, 680—684 (1970).

11. Laursen R. A., Eur. J. Biochem., 20, 89—102 (1971).

12. Noyes B. E.t Mevarech M„ Stein R., Agarwal K. L., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 76, 1770—1774 (1979).

13. Sood A. A., Pereira D., Weissman 5. Af., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 616—620 (1981).

14. Tarr G. E.f Beecher /. F., Bell Af., McKean D. /., Anal. Biochem., 84, 622— 627 (1978).

15. Wittmann-Liebold В., In: Polypeptide Hormones, Beers R. F., Jr., Basset E. G. (Eds.), Raven Press, New York, pp. 87—120 (1980).

16. Wittmann-Liebold В., Graffunder H., Kohls Anal. Biochem, 75, 621— 633 (1976).

Глава 18

ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТ

К. У. УАРД (С. W. WARD, Division of Protein Chemistry, CSIRO, Parkville, 3052 Victoria, Australia)

18.1. Введение

В то время как главные достижения в структурном анализе белка обязаны методу N-концевого отщепления аминокислот по Эдману, а применение автоматических секвенаторов позволило определить протяженные (40—70 остатков) последовательности аминокислот, структурный анализ белков с С-конца до сих пор находится в неудовлетворительном состоянии. Несмотря на бесспорную необходимость решения этой проблемы и большие усилия в этом направлении, ощутимых успехов пока не достигнуто.

Установление последовательности с С-конца требуется при определении структуры пептидов и белков в тех случаях, когда в изучаемых объектах N-концевая аминокислота блокирована уже в исходном природном материале (формильной, ацетильной или пироглутамильной группой) или в результате химических реакций, протекающих при расщеплении белка или фракционирования полипептидов; к таким реакциям относятся кар-бамоилирование [85], циклизация N-концевого глутамина в пи-роглутаминовую кислоту [8], образование иминотиазолинопа при расщеплении по остатку цианоцистеипа [20, 40], образование циклического амида из N-концевого S-карбоксиамидоме-тил- или S-карбоксиметилцистеина [80], О-НЧ-ацильная миграция с гидроксильных функций N-концевых Ser и Thr [81], перегруппировка аспарагинилглициновых последовательностей [10,43].

Надежные методы С-концевого анализа необходимы не только для определения ограниченных последовательностей аминокислот отдельных пептидов. Для широкого применения быстрых методов определения последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих белки, все чаще и сильнее ощущается потребность в знании как N-, так и С-концевых последовательностей соответствующих белков. Такие данные необходимы для правильного расположения инициирующего кодона и счи-

31—703

432

18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

тывающей рамки; для того чтобы разобраться в проблемах перекрывающейся экспрессии различных генных продуктов, считываемых с одной и той же последовательности нуклеиновых кислот в пределах одной и той же или же разных рамок считывания [5, 24], а также для того, чтобы определить, произошла ли протеолитическая модификация больших молекул предшественников. Объем необходимой информации о последовательности аминокислот белка зависит от типа нуклеиновой кислоты, структура которой определяется (мРНК или геномная ДНК). Если исходным материалом для анализа последовательности является мРНК, то достаточно ограниченной информации о N- и С-концевой последовательностях белка, так как кодирующая последовательность транслируемой области мРНК при считывании точно соответствует аминокислотной последовательности белка [56]. Однако при получении последовательности нуклеотидов геномной ДНК может потребоваться значительно больше данных о структуре белка, так как последовательность оснований, кодирующих конечный белок, может быть не беспрерывной, но включать большие участки не-транслируемой последовательности (интроны), которые затем проявляются на уровне мРНК [6, 16, 24, 52, 73].

В этой статье сделан обзор методик целенаправленного выделения С-концевых пептидов, которые затем можно изучать обычными методами N- и С-концевого анализа последовательности и(или) методом определения только одной С-концевой аминокислоты. В то время как методы преимущественного выделения С-концевых пептидов и идентификации С-концевых остатков развиты достаточно хорошо, методы прямого анализа С-концевой последовательности аминокислот практически вообще отсутствуют и в настоящее время не существует методик, обеспечивающих высокие постадийные выходы, определение протяженных последовательностей и сравнимых по эффективности с результатами N-концевого анализа по Эдману.

18.2. Выделение и идентификация С-концевых пептидов

Для выделения и идентификации С-концевых областей белков и пептидов предложено несколько методик. Все эти методики обеспечивают избирательное отделение С-концевого пептида от всех других пептидов методами ВЭЖХ, ионообменной хроматографии, двумерного высоковольтного электрофореза или специфического связывания ТФ-иосителями.

18.2.1. Методики ионообменной хроматографии

Маловероятно, чтобы описанные ниже методики получили широкое распространение; к ним будут обращаться в особых случаях. Предпринималась попытка локализовать С-концевой пеп-

18.2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ С-КОИЦЕВЫХ ПЕПТИДОВ 483

тид р-галактозидазы путем трипсинолиза малеилированного (для расщепления только по остаткам Arg) белка, последующего малеилирования смеси пептидов и пропускания ее через дауэкс-50 при рН 3—4 [100]. При этом полагалось, что все пептиды, за исключением С-концевого, заряжены положительно (благодаря наличию остатков Arg) и поэтому должны задерживаться на колонке (связываться с ионообменной смолой) ; один лишь незаряженный С-концевой пептид проходит через колонку без задержки. На практике этот подход оказался неудачным, так как С-концевой пептид р-галактозидазы при кислых значениях рН нерастворим. Этот метод неприменим к белкам, имеющим С-концевой Arg или содержащим в составе С-концевого пептида последовательность Arg-Pro или остаток His.

С-Коицевые пептиды А-цепи инсулина, лизоцима, цитохрома с, трипсина выделяли после блокирования всех свободных карбоксильных групп глициламидом при помощи водорастворимого карбодиимида (1-этил-3(3-диметиламинопропил) карбо-диимид, ЭДК) и расщепления полипептидов трипсином [33]. Все триптические пептиды, за исключением блокированного С-концевого, содержали свободные карбоксильные группы и присоединялись к анионообменной смоле AG-1-X2 (фирма Biorad). Перед хроматографией гидролизат обрабатывали карбоксипептидазой В, так как положительно заряженные Arg-содержащие пептиды не связывались со смолой и элюи-ровались вместе с С-концевым пептидом. Свободный Arg отделяли от С-концевого пептида гель-фильтрацией или катио-нообменной хроматографией. Несмотря на то что эта многостадийная методика представляется продолжительной, ее рекомендуют как простую и довольно быструю.

18.2.2. Твердофазные смолы

Создание твердофазных носителей для анализа последовательности [55] стимулировало разработку мощного метода селективного выделения С-концевых пептидов. В принципе можно селективно присоединить белок к смоле через С-концевой карбоксил белка, химически или фермеитативно расщепить иммобилизованный белок и селективно выделить С-концевой пептид, поскольку после гидролиза только он останется присоединенным к смоле. Однако на практике при активации С-концевого карбоксила активируются и карбоксильные группы боковых цепей Asp и Glu, которые затем связываются с носителем [51], что ограничивает возможности использования таких смол в качестве общего метода селективного выделения С-концевых фрагментов белков.

31*

484

18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

СН. -СН,

СН, -СН,

пептид NH СП ОН Тфу* пептид ¦ NH СН О

С ОН

о

Ш0

носитель

пептид NH

СН2

СН

с-6

с о

СН2 ОН

NH носитель

РИС. 18.1. Методика избирательного присоединения к носителю пептидов бро-моцианового гидролизата. В присутствии ТФУ остаток HSer превращается а лактон HSer. При аминолизе лактона пептид конденсируется с носителем.

Расщепление белков бромоцианом с последующей конденсацией HSer-содержащих пептидов на твердофазном носителе лежит в основе селективного выделения HSer-содержащих пептидов из смесей. Метод включает лактоиизацию остатков HSer обработкой ТФУ и последующий амииолиз HSer-лактона путем взаимодействия с аминогруппами смолы [37] (рис. 18.1).

HSer-содержащие пептиды с высоким выходом присоединяются к носителю карбоксильной группой пептида без предварительной защиты N- или С-коицевых аминокислот. Этот метод можно использовать для отделения С-копцевых HSer-содержащих пептидов из ферментативных гидролизатов крупных бро-моциановых пептидов [51], а также для удаления HSer-содержащих пептидов от С-концевого пептида, в котором отсутствует эта аминокислота [37]. Присоединение очень больших бро-моциановых пептидов может быть затруднено (малые выходы) из-за их плохой растворимости.

18.2.3. Двумерное пептидное картирование

До настоящего времени предложено несколько методов пептидного картирования. С-концевой пептид ^-цепи фетального гемоглобина идентифицировали, сравнивая электрофореграммы триптических гидролизатов после повторного разделения (рН 6,5) в направлении, перпендикулярном первому, до и после удаления С-копцевых остатков Arg или Lys при помощи карбоксипептидазы В прямо на листе бумаги [63]. Теоретически после обработки карбоксипептидазой на диагонали должен быть только С-концевой пептид. Однако в случае у-цепи гемоглобина человека на диагонали оказались 3 пятна, а именно свободный Lys, дипептид Val-Lys (так как дипептиды очень медленно расщепляются карбоксипептидазой [46]) и ожидае-

18.2. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ С-КОНЦЕВЫХ ПЕПТИДОВ 485

мый С-концевой пептид Tyr-His. Этот метод удобен для белков, у которых С-концевой аминокислотой является любой остаток, кроме Arg и Lys, а также для тех белков, триптические пептиды которых легко расщепляются карбоксипептидазой В.

Для обнаружения С-концевой области А-белка бактериальной триптофансинтетазы сравнивали карты трипсинолиза белка до и после обработки его смесью карбоксипептидаз А и В [15]. С-Концевая последовательность этого белка имеет состав А1а-Ala-Thr-Arg-Ser, и при частичном триптическом гидролизе на пептидной карте обнаруживаются три пятна, соответствующие Ala-Ala-Thr-Arg-Ser, Ala-Ala-Thr-Arg и свободному Ser. После обработки карбоксипептидазами исчезает только пятно Ala-Ala-Thr-Arg, потому что второй пептид и свободный Ser мигрируют на хроматограмме, сливаясь с другими пятнами. Успешное использование этого метода сильно зависит от полноты разделения пептидов на хроматограмме. Чем крупнее молекула белка, тем больше вероятность того, что будет потерян С-концевой пептид.

Из всех использованных методов пептидного картирования наиболее элегантным является метод диагонального электрофореза (ЭФ), основанный на отсутствии свободной карбоксильной группы в амидированных белках. Перед ферментативным расщеплением амидируют карбоксильные группы боковых цепей и С-концевой аминокислоты. После гидролиза С-концевой фрагмент оказывается единственным, не имеющим свободного карбоксила. Его можно селективно идентифицировать, так как его ионный заряд, а следовательно, и электрофоретическая подвижность почти одинаковы ' при изменении рН в любую сторону от рН 3,5 (р/С а-карбоксилыюй группы). Подвижности пептидов, содержащих свободную карбоксильную группу, увеличатся при подкислении раствора (рН<3,5). После двумерного ЭФ на диагонали электрофореграммы обнаруживается только С-концевой пептид.

В оригинальной методике [27] белок амидировали метиламином при помощи n-толуолсульфоната М-циклогексил-Ь]'-2-(4-р-морфолинил)этилкарбодиимида; проводили ферментативное расщепление, гидролизат подвергали высоковольтному ЭФ при рН 6,5 в первом направлении и рН 1,8 — во .втором. При этих условиях не обнаруживаются С-концевые пептиды, содержащие His, так как они сходят с диагонали. В модифицированной методике эта проблема снимается проведением ЭФ в первом направлении при рН 4,4; поэтому при проведении разделения в перпендикулярном направлении при рН 1,8 карбоксильные группы оказываются единственными, изменившими свой заряд [22]. Для амидирования белка использовали эта-ноламин, так как он легко растворим в воде, улучшает раство-

486 18. ОПРЕДЕЛЕНИЕ С-КОНЦЕВОИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

римость модифицированного белка и получаемых пептидов; он отсутствует в обычных белках и поддается количественному определению на аминокислотном анализаторе. В работе [22] при определении точного положения веществ, располагающихся на диагонали независимо от небольших изменений абсолютной подвижности или влияний электроосмоса, использовали в качестве маркеров амид Ala или таурин.

18.2.3.1. Выделение С-концевых пептидов. Ниже приведена методика выделения карбоксилсодержащих концевых пептидов а- и р-цепей гемоглобина человека [22]. Количество белка, необходимое для анализа, зависит от чувствительности метода обнаружения.

Амидированис. Белок (1,6 мкмоль, 50 мг) растворяют в 3 мл воды, содержащей несколько капель соляной кислоты. Добавляют 2,6 г мочевины, перемешивают 30 мин. Добавляют 0,3 г хлорида калия и 0,2 мл этаноламина, рН немедленно доводят до 4,75 при помощи соляной кислоты. Прибавляют 125 мг ЭДК, поддерживают рН 4,75. Перемешивают при комнатной температуре 4—6 ч, затем добавляют 1 мл 4 М ацетата натрия (рН 4,75). Раствор диализуют, несколько раз меняя воду.

По другой методике амидирование можно проводить в насыщенном растворе солянокислого гуанидина (1 мл), содержащем этаноламин (20 мкл, 300 мкмоль), при рН 4,7 (с помощью микрошприца добавляют

страница 75
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
наколенники вратарские футбольные
подвесные мобайлы
купить реечное днище для кровати 160*190
http://www.prokatmedia.ru/sound.html

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(17.11.2017)