химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ных смесей, обогащенных многими белками. В данном разделе описаны в деталях оригинальные методики, используемые для анализа последовательности белков, присутствующих в ДСН-гелях лишь в пикомольных количествах.

472

17. АНАЛИЗ НА МИКРОУРОВНЕ

10000 5000

2000 1000 500

о

^ 200

г ЮО

&

50

20 10

10000 пмоль

1^---—— ? ~д~--^-^i^

л VAL ? LEU I I i i средний выход 1 1

10ОО пмоль

д I I I 1 средний выход 95,6 %

U

: I I 100 пмоль

I I средний выход 93.9 %

5 -Ю пмоль

i i 1 А средний выход 92 % 1

10 15 20

Номер цикла

25

30

РИС. 17.4. Зависимость постадийных выходов отщепления аминокислот от количества апомиоглобииа кашалота. Показаны (в виде полулогарифмических зависимостей) выходы ФТГ-Val (циклы 1, 10, 13, 17, 21), ФТГ-Leu (циклы 2, 9, 11, 29, 32) при использовании 10 имоль, 1 имоль, 100 пмоль, 10 пмоль белка. Постадийный выход в каждом цикле рассчитывался по методу наименьших квадратов.

17.3.1. Реактивы и материалы

Использовались акриламид, 1Ч,М'-метиленбисакриламид и ДСН фирмы Bio-Rad Laboratories, кумасси бриллиантовый голубой фирмы Serva. Для элюирования и электрофоретического концентрирования белка использован ДСН, перекристаллизованный из этанола после обработки активированным углем при 50 °С. Качество других реактивов также должно быть наилучшим из всех доступных. Диализные мембраны марки Spectrapor (фирма Spectrum Medical Industries) очищали нагреванием при 60 °С в течение 30 мин последовательно в 1%-ном растворе бикарбоната натрия, дистилли-

17.3. ОЧИСТКА ПОЛИПЕПТИДА ДЛЯ МИКРОАНАЛИЗА

473

L_______1 ________I_____i_I_I

О 5 10 15 20 25

Номер цикла

РИС. 17.5. Выходы ФТГ-Val, Leu, Ala при анализе N-концевой последовательности 10 пмоль апомиоглобина кашалота. Для каждого производного выходы нормированы по стандартной смеси ФТГ-производных аминокислот.

рованной воде и 0,1%-ном растворе ДСН. Подготовленные мембраны хранились при комнатной температуре в свежем 0,1%-ном растворе ДСН, содержащем 0,02% азида натрия.

17.3.2. Аппаратура и методика

Для разворачивания полипептидной цепи образец нагревают в течение 5 мин при 80°С в 0,08 М трис-буфере (рН 6,8), содержащем 2% ДСН, 75 мМ ди-тиотреит (фирма Calbiochem), 10% (об./об.) глицерина и 0,05% бромотимо-лового голубого. После охлаждения до комнатной температуры к образцу добавляют тиогликолят натрия до концентрации 5 ммоль/л и проводят ДСН — ПААГ-элсктрофорез [10]. По завершении электрофореза гели окрашивают в - течение 15 мин в растворе, содержащем 20% изопропанола, 10% уксусной кислоты и 0,5% кумасси голубого, затем отмывают при 4 °С в растворе, содержащем 25% метанола и 10% уксусной кислоты. Гель с полосой белка, окрашенного кумасси, вырезают бритвенным лезвием, режут на небольшие кубики, которые оставляют на 1 ч набухать в дистиллированной воде для удаления уксусной кислоты и метанола. Избыток жидкости сливают с геля, оставляют частицы геля набухать в течение 2—16 ч при комнатной температуре в 0,5—1,0 мл раствора 0,2 М бикарбоната аммония, •содержащего 1% ДСН и 0,1% дитиотреита. Эта обработка нейтрализует остаточную кислотность и повторно насыщает белок ДСН.

Конструкция электрофоретического элюатора-концентраторя включает две камеры из оргстекла для загрузки и концентрирования образца, каждая из которых у дна закрыта диализной мембраной; камеры соединены друг с другом электролитическим мостиком. Прибор по конструкции сходен с коммерческой моделью фирмы Isco, за тем исключением, что меньшая камера (концентрирования) расширена у дна для выравнивания ее диаметра <с диаметром большей камеры (загрузки). Это конструктивное решение облегчает концентрирование белка через мембрану меньшей камеры, но вместе с тем ухудшает условия концентрирования ДСН, так как площади поверхности мембран, через которые происходит миграция ионов наружу и вовнутрь элюатора, одинаковы.

474

1Л АНАЛИЗ НА МИКРОУРОВНЕ

о ООО

2500

' 500

250 -

Т

2 6 2 6 2 6 Номер цикла

РИС. 17.6. Выходы ФТГ-производных аминокислот при анализе N-концевой последовательности б нмоль, 500 и 70 пмоль ангиотензина II (последовательность Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). Обработка результатов, как указано в подписи к рис. 17.5.

Частицы геля и уравновешивающий раствор, содержащий 1% ДСН, переносят в загрузочную камеру элюатора. Прибор заполняют 0,05 М бикарбонатом аммония, содержащем 0,1% ДСН и 0,5 мМ тиогликолята натрия. Сосуды для электродов заполняют тем же раствором. Электрофорез проводят в течение 16 ч при напряжении 50 В с рециркуляцией буферного раствора; затем электродный буферный, раствор заменяют раствором 10 мМ бикарбоната аммония, содержащего 0,02% ДСН. Электрофорез продолжают еще 20 ч при напряжении 80 В. При этом элюирующийся белок количественно концентрируется в объеме раствора <Ю0 мкл. Плотную зону кумасси голубого и белка удаляют с диализной мембраны микрошприцем (фирма Hamilton). Затем наносят образец на поверхность стекловолокнистого фильтра секвенатора.

17.4. Обсуждение

17.4.1. Иммобилизация образца и чувствительность прибора

По сравнению с секвенаторами других типов ГФ-прибор позволяет проводить определение аминокислотной последовательности белков (пептидов) на меньшем количестве материала [4].

I—t—г—i—i—i—г i—i—г—т -1—г

стандарт

0,002: 0,0015 0,0010 0,0005

M M I I I I I I I I I

цикл з

—i—т—i—т—i—i—t—г"т—i—i—г ЦИКЛ 1

M I II I M I M I I

—i—i—r—i—i—i—г

цикл 2

ЦИКЛ 4

цикл 5

0,002 -0,001 & 0,0010-3,000 5-

0

П I I I М I М М I I

I I I M I N I I I I I

ЦИКЛ 7

цикл 8

0,002

0,0015

0,0010

0r0 005

РИС. 17.7. Хроматограммы продуктов отщепления при анализе,аминокислотной последовательности 50 пмоль аигиотензииа II человека. Чувствительность О,005 ед. опт. плотн. на шкалу. Хроматограмма записана с помощью системы обработки данных (компьютер 3354, фирмы Hewlett-Packard) с вычитанием базовой линии, полученной в холостом анализе (в инжектор введено 10 мкл ацетонитрила). Порядок элюирования ФТГ-производных аминокислот (12,5 пмоль каждого): Asn, Ser, Thr, Gin, Gly, Ala, His, Asp-O-Me, Glu-O-Mc, Tyr, Val, Pro, Met, He, Leu, Phe, Trp, Lys, Arg. На колонку введено по 10 мкл раствора (40% каждого образца). Положение и природа аминокислот в циклах 1—6 показано в трехбуквенном обозначении. Положение ожидаемых ФТГ-производных аминокислот в циклах 7 и 8 показано таким же образом, хотя они и не обнаружены в эксперименте.

476

17. АНАЛИЗ НА МИКРОУРОВНЕ

Это преимущество обусловлено эффективной иммобилизацией образца в ходе расщепления по Эдману даже в отсутствие ко-валентного присоединения к твердофазному носителю. Пептид (белок) остается устойчиво связанным с фильтром по следующим причинам:

1) и основание (триметиламин — вода, реакция присоединения ФИТЦ), и кислота (ТФУ), реакция отщепления тиазолиио-на) подаются в раствор в газообразном состоянии;

2) образец закрепляется в пленке полибрена, что придает ему устойчивость к вымыванию органическими растворителями (бензол, этилацетат, 1-хлоробутан), используемыми для удаления избытка реагентов, основных и побочных продуктов реакций. Поскольку после нанесения на стекловолокиистый фильтр белок (пептид) связывается с фильтром, образующим рабочую поверхность реактора путем простого высушивания, то исключены начальные потери образца, присущие неэффективным методам ковалентного присоединения полипептида к носителю. То обстоятельство, что образец остается иммобилизованным в ходе повторяющихся циклов отщепления, дает возможность существенно уменьшить объем реакционной камеры, выполненной в виде небольшого стеклянного патрона. В отличие от ЖФ-секвенатора в ГФ-приборе для поддержания образца в виде тонкой пленки не требуется вращения реактора, так как полипептид перед анализом нанесен и высушен в виде пленки, которая остается нераствореиной в течение всех последующих процессов и не теряет своей формы. Проточный вариант конструкции реакционной ячейки позволяет избежать жестких требований к точности дозировки реагентов и растворителей. Реакции присоединения ФИТЦ и отщепления тиазолипопов происходят при подаче триметиламипа (ТМА) и ТФУ в газовой фазе. Единственный реактив, требующий точной дозировки, это ФИТЦ, который должен добавляться в количестве, обеспечивающем полное смачивание фильтра с образцом.

Использование пористого фильтра и проточного принципа проведения процесса позволяет проводить высокочувствительный анализ при низком уровне химического фона. Диск представляет собой сетку из переплетенных волокон, имеющую сильно развитую поверхность, на которой находится высушенная газо- и жидкостнопроницаемая пленка, состоящая из белка и полибрена. Кроме того, благодаря малой толщине пористого диска создается низкое сопротивление потоку жидкости. Это обеспечивает максимальный массообмен реактивов и растворителей с образцом. При малых скоростях потока можно достичь высокой эффективности и химических реакций, и экстракций, что позволяет экономно расходовать дорогостоящие реагенты и растворители (табл. 17.1).

17.4. ОБСУЖДЕНИЕ

477

При использовании малых объемов жидкостей сводится к минимуму и содержание примесей, присутствующих даже в ультрачистых реактивах и имеющих поглощение при длине волны детекции ФТГ-производных аминокислот (254 нм). При анализе последовательности на микроуровне (<Ю0 пикомоль исходного материала) надежность интерпретации хроматограмм ВЭЖХ в значительной степени зависит от возможности получения стабильной и воспроизводимой базовой линии при длине волны 254 нм (рис. 17.7).

17.4.2. Химические аспекты

Недавно было показано, что на стадии присоединения ФИТЦ к аминогруппе пептида вместо паров водного ТМА можно использовать пары безводного ТМА без заметного влияния на постадийный выход, чувствительность анализа и уровень фона (С. P. Hewick, М. Hunkapiller, неопубликованные данные). Безводное основание применяли при анализе как коротких пептидов, так и белков. Аминокислотный фон, полученный при определении последовательности миоглобииа в полностью безводных условиях оказался не меньшим, чем при проведении процесса с обычным водным раствором ТМА. Эти результаты указывают, что появление фона аминокислот в ГФ-приборе вызвано в основном не гидролизом пептидной связи, а другими химическими реакциями, как предполагалось ранее и для системы с вращающимся реактором [1].

17.4.3. Количество анализируемого образца

Представительный список исследованных образцов приведен в табл. 17.3. В настоящее время минимальное количество материала, необходимое для получения полезной информации о последовательности, составляет 5—10 пмоль (0,05—0,1 мкг) в случае белка среднего размера и 50 пмоль (0,05 мкг) для короткого пептида. Секвенирование сильно гликозилированных белков, таких, как эритропоэтип (60% углеводов), до сих пор не представляло особых проблем, хотя необходимо увеличивать время отщепления аминокислот, стоящих в цепи как до, так и после гликозилироваиного остатка, для сведения к минимуму содержания остаточных аминокислот, вызванного неполнотой отщепления предыдущих. Аналогичным образом поступают в случае последовательностей, содержащих пролин, сопровождаемый аминокислотными остатками, имеющими объемные боковые цепи (Lys, Arg, Leu в нейропептиде В из Aplysla).

Пожалуй, наиболее важное преимущество ГФ-секвенатора состоит в том, что, он позволяет анализировать следовые коли-

478 17- АНАЛИЗ HA МИКРОУРОВНЕ

Таблица 17.3. Пептиды, анализированные на ГФ-секвенаторе

Отношение числа Количество Анализируемый образец идентифицирован-

ных остатков к об-

щему числу остатков ПК ОЛЬ мкг

Ангиотензин 8/8 500 0,5

Ангиотензин 6/8 50 0,05

Соматостатин 14/14 1400 2,0

В-цепь инсулина 30/30 300 1,0

Нейропептид В из Aplysia 31/34 500 2,0

Динорфин 14/17 20 0,04

Миоглобнн 90/153 10 000 165

Миоглобин 22/153 5 0,08

Белок 1 кутикулы личинки дрозофилы3 55/166 850 15

Белок 3 кутикулы личинки дрозофилы3 36/96 900 9

Мембранный фосфопротеин (М 22-Ю3) из 23/200 15 0,3

Aplysia6 1,0

Фактор роста Т-клеток человека6 15/160 25 ¦а-цепь антигена HLA-DR гистосовместимо- 49/300 700 23

сти человека

р-нспь антигена HLA-DR гистосовместимо- 39/240 500 13

сти человека

Эритропоэтин человека3 28/150 100 1,6

Антиген поверхности клетки меланомы че- 13/850 60 5,5

ловекав

8 Очищен электрофокусированием в ПААГ, содержащем мочевину. ^Элюирован электрофоретически из ДСН — ПААГ, окрашенного кумасси голубым. в 60% углеводов по массе.

чества полипептидов, выделенных электрофорезом в полиакрил-амидных гелях в присутствии ДСН и элюированных из окрашенных гелей (антиген клеточной стенки меланомы, мембранный фосфопротеин из Aplysia, интерлейкин II или фактор роста Т-клеток).

17.4.4. Прогнозы

Сегодня в тех случаях, когда исследуемый белок может быть очищен лишь в следовых количествах, главным ограничением для получения данных об аминокислотном составе и последовательности аминокислот является качество выделенного образца. Во многих случаях, когда выход белка после очистки составляет 10—100 пмоль, существует большое расхождение между количеством материала, определенным по данным аминокислотного анализа, и количеством белка, оцененным по выходу первого ФТГ-производного аминокислоты. Такого различия в оценке содержания анализируемого объекта не наблюдается, когда имеют дело со следовыми количествами белка, взя-

17.4. ОБСУЖДЕНИЕ

479

того из большой навески чистого материала, и оно, вероятнее всего, отражает частичное блокирование N-концевых аминокислот, происходящее при выделении образца. В случае электрофоретического выделения полипептидов в ДСН—ПААГ минорные белковые компоненты можно защитить от окислительных модификаций добавлением восстановителей в наносимые образцы.

Снижение постадийных выходов, связанное с уменьшением количества носимого образца (рис. 17.4), является веским доказательством наличия следовых количеств окислителей в секвенаторе, даже если все реагенты и растворители были тщательно очищены. Предварительные результаты указывают на то, что еще более тонкая очистка всех реактивов и блокирования окислителей добавлением в растворители больших количеств восстанавливающих агентов, таких, как дитиотреит, может улучшить постадийные выходы при нанесении очень малых количеств образца.

Методически наиболее перспективно совместное использование высокой разрешающей способности ДСН—ПААГ-электро-фореза и анализа последовательности аминокислот на ГФ-сек-венаторе. В настоящее время можно получить частичную аминокислотную последовательность белка, полоска которого при окрашивании кумасси голубым едва видна в геле и который может представлять собой редко экспрессируемый компонент клетки. Данные о частичной аминокислотной последовательности такого белка можно использовать для синтеза олигонуклео-тидных праймеров (зондов), . необходимых для клонирования кДНК, комплементарной мРНК, с которой транслируется бел

страница 74
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
мячи в новосибирске
принтеры Zebra
Жилой комплекс Зачатьевский 1-й пер. д. 6, стр. 1 купить
колонки для мероприятий

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(18.11.2017)