химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

15, 777— 778 (1976).

92. Silver J., Hood L. ?, Anal. Biochem., 60, 285—292 (1974).

93. Smith C. W., Stahl G. L, Walter R., Int. J. Peptide Protein Res., 13, 109— 112 (1979).

94. Smithies O., Gibson D.t Fanning E. Af, Goodfliesh R. M., Gilman J. G, Ballantyne D. L, Biochemistry, 10, 4912—4921 (1971).

95. Stahl G. L., Walter R., Smith C. W., J. Org. Chem, 43, 2285—2286 (1978).

96. Stahl G. L, Smith C. W., Walter R„ J. Org. Chem., 44, 3424^3425 (1979).

97. Stahl G. L., Walter R.t Smith C. W., J. Am. Chem. Soc, 101, 5383—5394 (1979).

98. Stark G. R.} Methods Enzymol, 25, 369—384 (1972).

99. Tarr G. E., See Laursen R. A. (Ed,), pp. 139—147 (1975).

100. Tarr G. ?, Beecher F F, Bell M.t McKean D. У, Anal. Biochem, 84, 622— 627 (1978).

101. Tesser G. /, Lamberts J. J. Af, Int. J. Peptide Protein Res, 8, 559—563 (1976).

102. Thomsen F, Bucher D.t Brunfeldt K., Nexo E., Olesen H.y Eur. J. Biochem, 69, 87—96 (1976).

103. Uehara H., Ewenstein В. M., Martinko J. Af, Nathenson S. G, Coligan F ?, Kindt T. F, Biochemistry, 19, 306—315 (1980).

104. Ugi /, Angew Chem., 74, 9—22 (1962).

105. Wachter ?, Werhahn R.f See [821, PP- 185—192.

106. Wachter E., Hofner LF, Machleidt W.t See Laursen R. A. (Ed.), pp. 31—46 (1975).

107. Wilson K. /, Rodger K., Hughes G. J., FEBS Lett, 108, 87—91 (1979).

108. Wittmann-Liebold B.f Hoppe-Seyler's Z. Phvsiol. Chem, 354, 1415—1431 (1973).

109. Wittmann-Liebold В., Lehmann A., See Laursen R. A. (Ed.), pp. 81—90 (1975).

110. Wittmann-Liebold Geissler A. W., Marzinzig ?, J. Supramol. Struct 3 426—447 (1975).

111. Wittmann-Liebold ?, Brauer D.f Dognin See [821, PP- 219—232.

112. Yaun P.-M., Pande tf, Clark B. R., Shively J. ?, Anal. Biochem, 120, 289— 301 (1982).

Глава 17

АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НА МИКРОУРОВНЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГАЗОФАЗНОГО ПЕПТИДНО-БЕЛКОВОГО СЕКВЕНАТОРА

Р. М. ХЕУИК (R. М. HEWICK, Genetics Institute, 225 Longwood Avenue, Boston, Massachusetts 02115, U.S.A.), M. У. ХАНКАПИЛЛЕР (M. W. HUNKA-PILLER, Applied Biosystetns Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, California 94404, U.S.A.)

17.1. Введение

Автоматическое определение аминокислотной последовательности пептидов и белков по Эдману чаще всего проводят на жидкофазном (ЖФ) секвенаторе с вращающимся реактором [2]. В последние годы существенно усовершенствованы и ЖФ-секвенатор, и методы работы на нем [6, 9, 14—16]. Уделяя особое внимание тщательной очистке реагентов и растворителей, используемых как в секвенаторе, так и в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) отщепленных производных аминокислот, в настоящее время можно определять протяженные последовательности аминокислот (>30 остатков), располагая количествами пептида (белка) < 1 нмоль [7]. Основной недостаток ЖФ-апализа связан с вымыванием образцов, особенно гидрофобных пептидов. Применение полибрена* при анализе последовательности на ЖФ-сек-венаторе помогло решить эту проблему [6, 14].

Для устранения потерь с промывками образца был предложен твердофазный (ТФ) метод анализа [11]. Благодаря кова-лентиому присоединению изучаемого полипептида к химически модифицированной матрице носителя (на основе стекла или полистирола) исключены потери образца при промывке его органическими растворителями в процессе отщепления аминокислот. Простота конструкции колонки-реактора ТФ-секвепа-тора облегчает ее миниатюризацию, что позволяет повысить чувствительность определения последовательности. В то же время ковалентное присоединение пептидов и белков к носителю в гетерогенной системе не так просто осуществить, а выходы на этой стадии составляют лишь 20—50%. Реакции связывания белка (пептида) с матрицей носителя проводятся вне секвенатора, они весьма трудоемки и требуют длительного времени. Необходимо отметить, что планирование эксперимеи-

* Полибрен —- 1,5-диметил-1,5-диазаундекаметиленполиметобромид. — Прим. перев.

17.2. СЕКВЕИАТОР

465

тк по ковалентному присоединению полипептида до некоторой степени зависит от знания его аминокислотного состава. Существенный недостаток ТФ-метода заключается в том, что из-за' пропусков аминокислот в местах связывания полипептида с матрицей получают недостаточно полную информацию об аминокислотной последовательности пептида; кроме того, образец полностью теряется (вымывается из колонки) в случае, когда очередная отщепляемая аминокислота оказывается последней точкой присоединения пептида к носителю.

Недавно был разработан миниатюрный секвеиатор нового типа — газофазный, в котором для проведения реакции Эдмапа используются газообразные реагенты [4, 8]. Единственными жидкостями, вступающими в контакт с пленкой белка (пептида), являются фенилизотиоциапат и органические растворители, в которых белок плохо растворим. Вымывание гидрофобных пептидов и белков, связанных с додецилсульфонатом натрия (ДСН), предотвращают добавлением полибрена.

Изучаемый пептид наносят на пористый фильтр, который затем высушивают; таким образом получают тонкую пленку образца в реакционной камере ГФ-секвенатора. Пептид очень прочно связан с фильтром, даже не будучи ковалентно присоединенным к нему. Поскольку образец находится в одном и том же физическом состоянии в течение всего процесса определения по Эдману, то вместо громоздкой и сложной в изготовлении системы с вращающимся реактором используют миниатюрный реакционный сосуд проточного типа. Уменьшение размеров реактора ведет к дальнейшему снижению расхода изучаемого материала по сравнению с ЖФ-секвепатором [7]. При работе на ГФ-секвеиаторе требуется значительно меньше реактивов, расщепление по Эдману проходит быстрее; конструктивно ГФ-секвенатор устроен проще, чем ЖФ-прибор.

В этой главе рассмотрены наиболее важные конструкционные особенности ГФ-секвенатора, особенности методик, с успехом применяющихся для анализа структуры па микроуровне (<100 пмоль) пептидов, элюированных из ДСН-полиакрил-амидных гелей (ДСН—ПААГ).

17.2. Секвеиатор

Устройство ГФ-секвенатора подробно изложено в работе [4]. Ниже отмечены только некоторые особенности конструкции прибора и работы на нем (рис. 17.1). Существует коммерческий вариант секвенатора (см. прим. ред. в конце главы), который отличается от прототипа следующим:

1) электрическое (вместо пневматического) включение клапанов, подающих реагенты и растворители;

30—703

ИСТОЧНИК I

аргона j

о ловушка для

Н^О мелких

| нас тиц

ловушки система распределения аргона

|^ слив ^_J

вентиляция

С^с|)Н<уЧ С>4 <^Н <|)Н с|>Н

О

г 1

L 1

линия подачи жидкости

гГ0

подана газа

система подачи ^ реагентов и рас- ? творителей

реактор

) слив Ar S4R4 аргон

• • • • • •

Выхлоп ¦

командное устройство

декодирующее устройство

система управления

РИС. 17.1. Схема газофазного секвенатора.

17.2. СЕКВЕИАТОР

467

2) микропроцессорное управление прибором (вместо программирующего устройства с жестким циклом работы) с возможностью изменения параметров реакции в отдельных циклах (например, можно увеличить время отщепления в тех циклах, где предполагается присутствие остатков пролина).

17.2.1. Реактор

Реактор состоит из двух стеклянных (пирекс) цилиндров (длина 25,4 мм, диаметр 25,4 мм), плоские основания которых (торцы) отшлифованы для обеспечения вакуумно-плотного соединения. По оси цилиндров ультразвуком просверлены капиллярные каналы диаметром 0,508 мм. Последующей обработкой одного торца каждого цилиндра при входе в капиллярный капал делают коническую выемку, так что при соединении двух цилиндров коническими углублениями навстречу друг другу образуется камера малого объема (рис. 17.2). В коническое углубление верхнего стеклянного блока помещают фильтр в виде плоского диска диаметром 12 мм, изготовленный из стекловолокна (фильтр марки GF/C, фирма Whatman). Под стек-ловолокнистый фильтр кладут топкий пористый тефлоновый фильтр, который, во-первых, обеспечивает вакуумное уплотнение по периферии реакционной камеры, во-вторых, служит механической подложкой для фильтра из стекловолокна (GF/C). В увеличенном виде реактор в сборке показан на рис. 17.3.

С подробным описанием устройства подающих клапанов, сосудов для реагентов и растворителей, коллектора фракции и конвертора, используемых в секвенаторе, можно ознакомиться в работе [9].

17.2.2. Реагенты и растворители

Примерные расходуемые объемы реагентов и растворителей для ГФ-секвенатора приведены в табл. 17.1. Там же для сравнения указаны соответствующие объемы реактивов для ЖФ-секвенатора [6].

17.2.3. Эксплуатация секвенатора

17.2.3.1. Нанесение образца. Перед нанесением образца реактор (рис. 17.2) разбирают. Для этого откручивают винт У, кольцо-фиксатор 8, вынимают реактор в сборке из основания 9. Откручивают алюминиевую крышку 3, вынимают оба стеклянных цилиндра 7 из патрона 6. Удаляют использованные диски (стеклофильтр и тефлоновый фильтр). Стеклянные цилиндры промывают поочередно водой, 1 М уксусной кислотой, водой, 1 М едким натром, водой, метанолом (марки «для ВЭЖХ»), В торцевую выемку верхнего цилиндра помещают новый стеклофильтр, наносят на него по 0,025 мл водного раствора полибрена (60 мг/мл) и глицилглицина (1 мкм/мл). Затем фильтр сушат в вакууме, между двумя торцевыми поверхностями цилиндров, образующими реакционную камеру, кладут новый тефлоновый фильтр, собирают

30*

468

17. АНАЛИЗ НА МИКРОУРОВНЕ

к вакуумной линии, конвертору, сливу

РИС. 17.2. Реактор в сборе.

1 — верхнее уплотнение; 2 — тефлоновая линия; 3 — алюминиевая крышка; 4 — тефлоно-вая прокладка; 5 — уплотнение; 6 — направляющая гильза (нержавеющая сталь); 7 — стеклянный цилиндр (пирекс); 8 — кольцо-фиксатор; 9 — основание реактора; 10 — нижнее уплотнение; И — блок клапанов.

стекловолокнис-

тый диск поток стекло пирекс

РИС. 17.3. Реакционная камера (увеличенное изображение).

Таблица 17.1. Сравнение расхода реагентов и растворителей при проведении одного цикла отщеплеййй

по Эдману на ЖФ и ГФ-секвенаторах

ЖФ-секвенатор (реагеит/растворитель) ^шГ*' ГФ-секвеиатор (реагент/растворитель) Объем, мл

Я; ФИТЦ в гептане3 0,4 15%-ный ФИТЦ в я-гептане6 0,05

R2 Квадрол — ТФУ (рН 9,0) в смеси 0,7 15%-ный водный триметиламинв 5 см3/мин (в потоке

вода — «-пропанол (4 : 3) аргона)

ГФМК 0,5 ТФУ, содержащая 0,01% дитиотреи- 5 см3/мин (в потоке

таг аргона)

R4 25%-ная водная ТФУ (расход не 0,5Д 25%-ная водная ТФУ, содержащая 0,05 указан) 0,01% дитиотреита

51 Бензол 7 Бензол0 1,1

52 Этил ацетат, содержащий 0,05% 16 Этилацетат, содержащий 0,05% ук- 1,2 уксусной кислоты и 0,002% дитио- сусной кислоты и 0,002% дитиотреита треита

53 1-хлоробутан, содержащий 0,001% ди- 7 1-Хлоробутан, содержащий 0,001% J2 тиотреита дитиотреита *

54 Ацетонитрил, содержащий 0,001% 4 Ацетонитрил, содержащий 0,001% Q33 дитиотреита дитиотреита* '

В настоящее время про!рамма работы изменена следующим образом: а5%-ный раствор; ^5%-ный раствор; в12,5%-ный раствор; гподается не в виде паров, а в жидком состоянии (9 мкл); Д приведено переводчиком; ебензол заменен на «-гептан; ж20%-ный водный ацетонитрил. — Прим. перев. Промывка конвертора не включена в этот объем.

470

17. АНАЛИЗ НА МИКРОУРОВНЕ

Таблица 17.2. Программа работы газофазного секвенатора

Реактор

Конвертор

СЛИВ <4-

слив

слив

СЛИВ <4-

слив

СЛИВ*

ва

отщепление Спары ТФУ)

продувка вакуум

экстракция О-хлоробутаЮ

продувка вакуум

ФИТи,;продувка, карбамоилиро-вамие

(пары ТМА)

I

продувка вакуум

ФИТЦ,продувка, карбамоилиро-ва:;ие

(пары ТМА)

продувка вакуум

экстракция

1. бензол

2. этил ацетат

т

продувка вакуум

отщепление (пары ТФУ)

Т продувка

вакуум _I_

экстракция (1 -хлоробутан)

450 с

500 с

450 с

25% ТФУ

превращение анилинотиазо-линон—> ФТГ

то с

вакуум

экстракция ФТГ (ацетонитрил)

коллектор

350 с

>перенос в конвертор

вакуум сушка

продувка вакуум _1_

вакуум

17.3. ОЧИСТКА ПОЛИПЕПТИДА ДЛЯ МИКРОАНАЛИЗА

471

реактор и проводят по крайней мере четыре цикла отщепления. После такой предварительной химической обработки стеклофильтра реактор разбирают, вынимают верхний цилиндр, несущий этот фильтр. Оставляя последний в коническом углублении, переворачивают цилиндр фильтром вверх, наносят на фильтр раствор полипептида (аликвотами по 0,025 мл), сушат фильтр. Собирают реактор и начинают анализ аминокислотной последовательности на секвенаторе.

17.2.3.2, Программа работы секвенатора. Последовательность операций, проводимых на секвенаторе, в основном аналогичная описанной ранее [4] и в общем виде отражена в табл. 17.2, Недавно в программу были внесены следующие изменения:

1) снижена скорость потока этилацетата (за общее время экстракции 250 с добавляется 1,2 мл); анализ фракции элюата с секвенатора методом ВЭЖХ (шкала чувствительности 0,005 ед. опт. плотн.) показал, что такая модификация фактически исключает появление побочных продуктов расщепления по Эдману, поглощающих при длине волны 254 нм;

2) увеличено общее время операции отщепления при 42 °С (от 650 до 800 с).

17.2.3.3. Эксплуатационные возможности. Для оценки возможностей прибора методом ВЭЖХ определяли выходы ФТГ-производных аминокислот (поста-дийные выходы) для различных количеств апомиоглобина кашалота [4]. Для образцов, содержащих 10 нмоль — 5 пмоль миоглобина (рис. 17.4), выходы составляли: 98% (Ю нмоль), 96% (500 пмоль), 94% (50 пмоль) и 92% (5 пмоль). Снижение постадийного выхода, наблюдаемое при уменьшении количества наносимого образца, вероятнее всего, связано с наличием следовых количеств окислителей в реактивах и в самом секвенаторе. На уровне 10 нмоль можно определить последовательность первых 90 остатков миоглобина, на уровне 5 пмоль получены данные о частичной последовательности 22 аминокислот (рис. 17.5). В число остатков, не идентифицированных на уровне 5 пмоль, входят производные аминокислот, хуже других растворимые в 1-хлоробутане (например, ФТГ-His и ФТГ-Arg), и наиболее неустойчивые производные аминокислот (Ser, Thr и Тгр).

Возможности секвенатора в отношении коротких гидрофобных пептидов оценивались на примере октапептида ангиотензина II человека (рис. 17.6). Анализируя как 5 имоль (5 мкг исходного вещества), так и 500 пмоль (0,5 мкг), авторы идентифицировали все восемь отщепленных производных аминокислот. При работе с 50 пмоль того же образца не были обнаружены только два последних остатка — Pro и Phe. Соответствующие хроматограммы ВЭЖХ приведены на рис. 17.7.

17.3. Очистка полипептида для микроанализа

Важное достоинство ГФ-секвенатора заключается в' том, что с его помощью можно проводить анализ малых количеств белка, нанесенного в присутствии ДСН. Высокая разрешающая способность ДСН—ПААГ-электрофореза делает этот метод мощным средством выделения в чистом виде труднодоступных белков из слож

страница 73
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
wok сковорода для индукционной плиты
стоимость привода воздушной заслонки gma 321
cryos в санкт-петербурге купить
сетка рабица московская область

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.05.2017)