химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

36]. Однако необходимая для этого активация карбоксилов может привести к блокированию N-концевой аминогруппы и вызвать внутреннюю циклизацию остатков Asp.

Для снижения потерь пептида с экстракциями предложен и другой подход. После проведения стадии карбамоилироваиия квадрол не экстрагируют растворителями, а оставляют в реакторе для получения гидрофильной пленки, удерживающей пептид [25]. Однако сохранение квадрола в реакторе невыгодно, лбо в результате добавления его в каждом цикле после проведения нескольких циклов в реакторе накапливается большое количество солей.

Предполагалось, что «якорем», удерживающим пептид в реакторе, может служить белок с блокированной N-концевой аминокислотой, не вступающий в реакцию Эдмана. С этой целью использовался парвальбумин [89].

Но этот белок при воздействии кислоты подвергается хаотическому расщеплению; появляются новые последовательности, возрастает уровень фона ФТГ-аминокислот. Удерживание малых или гидрофобных пептидов в реакторе значительно возрастает в присутствии полибрена — синтетического полимера, имеющего положительно заряженные четвертичные атомы азота и инертного в условиях анализа последовательности [59, 100]. Мы использовали его при работе с очень большими пептидами, содержащими много неполярных аминокислот. Для некоторых пептидов получены хорошие результаты; в то же время мы не заметили существенного влияния добавления полибрена при работе с другими большими фрагментами или целыми белками. Более того, при использовании полибрена мы наблюдали снижение начальных выходов (см. также гл. 15).

16.3.3. Анализ на микроуровне

Во многих случаях требуется проводить анализ малых количеств труднодоступного белка. Для снижения расхода анализируемого материала до 1—10 нмоль потребовалось значительное усовершенствование существующих методов. Например, модификация ЖФ-секвенатора включала создание системы стабильного высокого вакуума, разработку новых методик экстракции, использование специально сконструированных герметичных клапанов подачи реагентов с нулевыми мертвыми объемами, введение в схему прибора автоматического конвертора [108—ПО]. Эти усовершенствования были подхвачены и объединены с системой высокоэффективной очистки реагентов, растворителей и с использованием полибрена [47]. В послед-лей работе, израсходовав всего 200 пмоль образца, удалось

16.3. АВТОМАТИЧЕСКИЙ ЖИДКОФЛЗНЫЙ АНАЛИЗ

459

определить последовательность 47 остатков миоглобина кашалота; постадийные выходы составляли 95,5%. Для улучшения рабочих параметров ЖФ-секвенатора был сконструирован прибор новой конструкции [48] (см. также гл. 17). На этом приборе удалось определить протяженные последовательности, анализируя 20 пмоль белка или 200 пмоль пептидов. Попытки дальнейшего увеличения чувствительности с использованием всех вышеупомянутых методик большого успеха не имели, так как по-прежнему не решены проблемы вымывания образца в каждом цикле отщепления и загрязнения ФТГ-аминокислот примесями, образующимися в ходе процесса.

Использование высокочувствительных методик с применением радиоактивности помогло преодолеть часть этих проблем. Радиоактивная метка вводится либо в аминокислоты (биосин-тетически), либо в реагенты, используемые для анализа последовательности. Белки, меченные биосинтетически in vivo или in vitro, должны быть очищены с помощью микрометодов; ва многих случаях продукт, пригодный для анализа, можно получить при помощи иммуиохимической очистки. В различных лабораториях анализировали радиоактивно меченные белки, расходуя 0,1 —1,0 пмоль материала [79, 103]. Единственным крупным недостатком этого метода является то, что не все белки можно метить in vivo или в культуре ткани из-за низкого их содержания и (или) малой скорости синтеза.

Примером использования радиоактивно меченных реагентов служит работа [54]. В каждом цикле отщепления белок обрабатывают сначала [355]ФИТЦ, затем «холодным» ФИТЦ. Этим методом удалось ' установить последовательность ~20 аминокислот, израсходовав 5—15 пмоль белка. В разд. 16.2.4.4 рассмотрено применение этого подхода в ТФ-аиализе последовательности [17, 18]. Недостатком метода, как в случае ЖФ, так и в случае обычного ТФ-ссквенатора, является большой расход реагента, необходимый для того, чтобы покрыть большую площадь поверхности реактора секвенатора. Это в свою очередь ведет к высокому уровню радиоактивного фона в анализе очень малых количеств образца и делает сам анализ и дорогим, и опасным.

В последнее время постоянно увеличивается _ применение ВЭЖХ в анализе последовательности аминокислот на микро-уровне (гл. 6). Это позволяет выделить микрограммовые количества пептидов в виде растворов, пригодных для прямого нанесения в реактор секвенатора [112]. Важным дополнительным методом анализа коротких пептидов является масс-спектромет-рия [12, 60, 73]; чрезвычайно высокая чувствительность этого метода может способствовать его широкому предпочтительному распространению.

460

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

16.4. Заключение

Мы уверены в том, что потребность в быстром, удобном и высокочувствительном анализе последовательности белков и пептидов в ближайшие годы значительно возрастает. Понимание природы и механизма управления клеточной дифференциров-кой потребует однозначной идентификации и описания свойств многих рецепторов и эффекторов клеточной мембраны и многочисленных пептидов, включенных в передачу сигналов между клетками (гормоны, рилизинг-факторы и т. д.). Изучение структуры и организации генов проводится различными методами, дающими последовательности ДНК, которые можно перевести в белковые последовательности. Перевод последовательности мРНК в аминокислотную последовательность белка будет отчасти зависеть от независимо проведенного определения структуры пептидов.

Одного лишь определения последовательности нуклеотидов ДНК никогда не будет достаточно для установления точек посттрансляционной модификации белка.

При сравнении реально используемых методов анализа последовательности с сегодняшними и будущими требованиями становится ясно, что требуются новые «прорывы» в методологии, В создании автоматизированного оборудования для анализа структуры и сопутствующих методов достигнуты громадные успехи. Но совершенство оборудования оказалось фактором, ограничивающим развитие будущей методологии. Это ограничение можно преодолеть только энергичным проведением новых исследований химических аспектов анализа структуры. Мы полагаем, что наибольший выигрыш в развитии высокочувствительных методов установления аминокислотной последовательности может быть получен при использовании новых химических идей именно в ТФ-анализе, где первоочередное внимание следует уделять кинетике реакций, носителям, миниатюризации приборов. В некоторых случаях химический и ферментативный подходы в сочетании с масс-спектрометрическим анализом могут играть важную роль в новой методологии. Мы надеемся, что многие исследователи осознают важность этой задачи.

Литература

1. Apelta Е., Inman I. K.r Dubois G. С, See Previero A.t Coletti-Previero M.-A. (Eds.), pp. 121—133 (1977).

2. Arshady R., Atherton E.t Gait M. /., Lee K., Sheppard R. C, J. Chem. Soc, Chem. Commun., 1979, 423—425 (1979).

3. Atherton E.t Gait M. J., Sheppard R. C, Williams B. Bioorganic Chemistry, 8, 351—370 (1979).

4. Barrett G, C.t J. Chem. Soc., Chem. Commun., 487—488 (1967).

ЛИТЕРАТУРА

461

5. Barrett G. С., Chapman J. R.y J. Chem. Soc., Chem. Commun., 335—336 (1968).

6. Barrett G. C, Khokhar A. R., J. Chromatogr., 39, 47—52 (1969).

7. Barrett G. C, Leigh P. //., FEBS Lett., 57, 19—21 (1975).

8. Barrett G. C, Hume Usmani A. A., See [82], pp. 57—68.

9. Bayer ?., Mutter M., Polster Uhmann R.y In: Peptides 1974, Proc. Thirteenth European Peptide Symposium, Wolman Y. (Ed.), Wiley, New York, pp. 129—136 (1975).

10. Begg G. S.t Morgan F. FEBS Lett., 66, 243—245 (1976).

11. Begg G. S., Pepper D. S., Chesterman C. ЛЛ, Morgan F. /., Biochemistry, 17, 1739—1744 (1978).

12. Biemann K., In Chemical Synthesis and Sequencing of Peptides and Proteins, Liu T.-Y., Schechter A. N, Heinrikson R. L., Condliffe P. G. (Eds.), Elsevier/North-Holland, New York, pp. 131—148 (1981).

13. Birr C. (Ed.), Methods in Peptide and Protein Sequence Analysis, Proc, Third Internat. Conf., Elsevier/North Holland, Amsterdam, New York, Oxford, pp. 1—531 (1980).

14. Berr C, Garoff H.t See [821, PP- 177—183.

15. Brandt W. F., Edman P., Henschen A„ Von Holt C, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 357, 1505—1508 (1976).

16. Braunitzer G,, Schrank В., Ruhfus A., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 351, 1589—1590 (1970).

17. Bridgen /., Biochemistry, 15, 3600—3604 (1976).

18. Bridgen F, Waxdal M. У., See [82|, pp. 153—162.

19. Cavadore F-C.t Anal. Biochem., 91, 236—240 (1978).

20. Cavadore J.-C, Vallet В., Anal. Biochem., 84, 402—405 (1978).

21. Chang J. Y., Creaser E. H., Hughes G. /., FEBS Lett., 78, 147—150 (1977).

22. Chang J. Y.t Creaser ?. H.t Hughes G. /., FEBS Lett., 84, 187—190

(1977) .

23. Chang F Y., Brauer D., Wittmann-Liebold В., FEBS Lett., 93, 205—214

(1978) .

24. Chang F Y.f Lehmann A., Wittmann-Liebold В., Anal. Biochem., 102, 380— 383 (1980).

25. Crewther W. G., Inglis A. S., Anal. Biochem., 68, 572—585 (1975).

26. Darbre A., Methods Enzymol., 47, 357—369 (1977).

27. Darbre A.t Rangarajan Af., See Laursen R. A. (Ed.), pp. 131 — 137 (1975).

28. DiBelto C, Marigo A., Buso O., Lucchiari A., Tetrahedron Lett. no. 13, 1135—1136 (1977).

29. Doolittle L. R.t Mross G. A., Pother gill L. A., Doolittle R. F., Anal. Biochem., 78, 491—505 (1977).

30. Dwulet F. ?., Gurd F. R. Лг., Anal. Biochem., 76, 530—538 (1976).

31. Edman P., In: Protein Sequence Determination, Needleman S. B. (Ed.), Springer, Berlin, Heidelberg, New York, pp. 232—279 (1975).

32. Edman P., Begg G., Eur. J. Biochem., 1, 80—91 (1967).

33. Elzinga AL (Ed.), Methods in Protein Sequence Analysis, Proc. Fourth Internat. Conf., Hummana Press, Clifton, New Jersey, prr. 1—589 (1982).

34. Fairwell Т., Brewer H. В., Jr., Anal. Biochem., 99, 242—248 (1979).

35. Fankhauser P., Brenner AL, In: The Chemistry of Polypeptides, Katsoyan-nis P. G. (Ed.), Plenum Press, New York, pp. 389—411 (1973).

36. Foster J. A., Bruenger ?., Ни С. L.t Albertson K., Franzblau C, Biochem. Biophys. Res. Commun., 53, 70—74 (1973).

37. Fujino M., Kobayashi S., Obayashi M., Fukuda Т., Shinagawa S., Nishi-mura O., Chem. Pharm. Bull., 22, 1857—1863 (1974).

38. Gross H.t Bilk L., Tetrahedron, 24, 6935—6939 (1968).

39. Hancock W. S., Prescott D. J., Vagelos P. R., Marshall G. R. J. Org. Chem., 38, 774—781 (1973).

462

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

40. Her brink P., Tesser G. F, Lamberts J. /. AL, FEBS Lett., 60, 313—316; (1975).

41. Hermodson M. A., Ericsson L. H., Titani K., Neurath Walsh K. A.j Biochemistry, 11, 4493—4502 (1972).

42. Hewick R. AL, Hunkapiller AL W.M Hood L. E.t Dreyer W. /., J. Biol. Chem., 256, 7990—7997 (1981).

43. Horn AL L, See Laursen R. A. (Ed.), pp. 51—60 (1975).

44. Horn M. F, Bonner A. G., See [82], pp. 163—176.

45. Horn M. A, Laursen R. A., FEBS Lett., 36, 285—288 (1973).

46. Hughes G. /., Winterhalter K. H., Lutz tf, Wilson K. /., FEBS Lett., 108, 92_97 (1979),

47. Hunkapiller AL W., Hood L. E.t Biochemistry, 17, 2124—2133 (1978).

48. Hunkapiller M. W., Hood L. E.t Science, 207, 523—525 (1980).

49. Inglis A. S.t Maclaren I. A., Proc. Australian Biochem. Soc, 4, 31 Abst (1971),

50. Inman J. A., Appella E., See Laursen R. A. (Ed,), pp. 241—253 (1975).

51. Inman F A., Apelta E., Methods Enzymol., 47, 374—385 (1977).

52. Inman J. K., Hannon J. E.f Appella E.t Biochem. Biophys. Res. Commun., 46, 2075—2081 (1972).

53. Inman J. K., DuBois G. C, Appella E., See [82], pp. 81—94.

54. Jacobs F W., Niall H. ?>., J. Biol. Chem., 250, 3629^-3636 (1975).

55. Jakubke H.-D., Klessen Ch. J. f. Prakt. Chem., 319, 159—162 (1977).

56. Jentsch J., See Laursen R. A. (Ed.), pp. 193—202 (1975).

57. Jomvall H., Inman A A., Appella Anal. Biochem., 90, 651—661 (1978).

58. Kasselt В., Krishnamurti C, Friedman H. L., See [82], pp. 39—48.

59. Klapper K. G., Wilde С. E., Ill, Capra F D., Anal. Biochem., 85, 126—131 (1978).

60. Krutzsch H. C, In: Chemical Synthesis and Sequencing of Peptides and Proteins, Liu T.-Y., Schechter A. N.. Heinrikson R. L., Condliffe P. G. (Eds.), Elsevier/North-Holland, New York, pp. 149—159 (1981).

61. Laursen R. A„ J. Am. Chem. Soc, 88, 5344—5346 (1966).

62. Laursen R. A., Eur. J. Biochem., 20, 89^102 (1971).

63. Laursen R. A. (Ed.), Solid Phase Methods in Protein Sequence Analysis, Proc First Internat. Conf., Pierce, Rockford Illinois USA, pp. 1—282

(1975) .

64. Laursen R. A., Methods Enzymol., 47, 277—299 (1977).

65. Laursen R. A., See [821, PP- 95—106.

66. Lee H.-M., Riordan J. F., Anal. Biochem., 89, 136—142 (1978).

67. Ultalien J. J., Laursen R. A., J. Biol. Chem., 256, 8092—8101 (1981).

68. Loudon G. AL, Par ham Af. E., Tetrahedron Lett., no. 5, 437—440 (1978).

69. Low AL, Kisfaludy L.f Acta Chim. Acad. Sci. Hung. 44, 61—66 (1965).

70. Machletdt W., Wachter E., Methods Enzymol, 47, 263—277 (1977).

71. Mech C, Jeschkeit //., Schellenberger A., Eur. J. Biochem., 66, 133—138

(1976) .

72. Merrifield R. B.} J. Am. Chem. Soc, 85, 2149'—2154 (1963).

73. Morris H. R.t Mature (Lond.), 286, 447—452 (1980).

74. Mross G. A., Doolittle R. F.t Fed. Proc, 30, 1241 Abs. (1971).

75. Mross G. A., Doolittle R. F., In: Advanced Methods in Protein Sequence Determination, Needleman S. B. (Ed.), Springer, Berlin, Heidelberg New York, pp. 1—20 (1977).

76. Mutter AL, Bayer Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 13, 88—89 (1974).

77. Niall H. D.t Penhasi H., Gilbert P., Myers R. C, Williams F. G.t Potts /. 7. /г., Fed. Proc, 28, 661 Abs (1969).

78. Niall H. D., Jacobs J. W„ Van Rietschoten /., Tregear G. W.t FEBS Lett, 41, 62—64 (1974).

79. Palmiter R. D., Gagnon J.f Ericsson L. H., Walsh K. A., J. Biol. Chem., 252, 6386—6393 (1977).

ЛИТЕРАТУРА

463

\80. Previero A., Methods Enzymol., 47, 289—299 (1977). Bl. Previero A., Cavadore J.-C, See [631, PP- 63—72.

\S2. Previero A., Coletti-Previero M.-A. (Eds.), Solid Phase Methods in Protein Sequence Analysis, Proc. Second Internat. Conf., North-Holland, Amsterdam, pp. 1—296.

183. Previero A., Coletti-Previero M.-A., See [82], pp. 49—56.

«4. Previero A., Pechere /.-F., Biochem. Biophys. Res. Commun., 40, 549—556 (1970).

85. Previero A., Derancourt Coletti-Previero M.-A., Laursen R. A., FEBS Lett., 33, 135—138 (1975).

86. Previero A.t Gourdol A., Derancourt F, Coletti-Previero M.-A., FEBS Lett., 51, 68—72 (1975).

87. Regen S. L.t J. Am. Chem. Soc, 99, 3838—3840 (1977).

88. Regen S. L., Dulak L„ J. Am. Chem. Soc, 99, 623—625 (1977),

89. Rochat H., Bechis G, Kopeyan C, Gregoire Van Rietschoten J., FEBS Lett., 64, 404—408 (1976).

90. Schiltz ?, See Laursen R. A. (Ed.), pp. 47—50 (1975).

91. Schutienberg H.} Schulz R. C, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,

страница 72
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
клапан клоп 1000х500 лиссант цена
угловые кровати с подъемным механизмом
такси по безналичному расчету
комод купить дешево в москве

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(19.10.2017)