химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

после реакции взаимодействия ДАБИТЦ с полипептидом для полной «забивки» N-концевых аминогрупп проводят дополнительную реакцию с более эффективно реагирующими ФИТЦ. Получающиеся ФТГ-аминокислоты бесцветны и не мешают идентификации окрашенных тиогидантоинов [23]. По нашему мнению, проведение реакции в колонке (ручным методом или автоматическим) дает значительные преимущества по сравнению с исходным вариантом метода (реакция в пробирке) [21]. Мы успешно проводили ручное ТФ-определение последовательности (при помощи ФИТЦ) на малых количествах пептидил-носителя, помещенного поверх крошечного кусочка стеклянной ваты в сужен-

29*

452

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

ной части пастеровской пипетки. Последнюю укоротили с обоих концов; получившуюся маленькую колонку обогревали внутри пробирки, помещенной в баню с пропиленгликолем; промывку колонки легче проводить, приложив небольшое избыточное давление азота.

16.2.5. Другие методы последовательного отщепления

Твердофазный метод позволяет использовать для анализа аминокислотной последовательности подходы, отличающиеся от реакции Эдмана. Многие реагенты, пригодные для проведения альтернативных химических реакций, нельзя применять в ЖФ-методе из-за того, что простой экстракцией часто невозможно полностью удалить избыток реагентов и продукты побочных реакций.

Ниже изложены основы нескольких альтернативных подходов, рассматриваются их возможности и ограничения.

16.2.5.1. Определение N-концевой последовательности при помощи тиоацилирования и кислотного отщепления. Несколько методов последовательного отщепления основаны на присоединении тиоацильной группы R = C = S к N-концевой аминогруппе пептида с последующей циклизацией N-концевого остатка в кислых условиях и отщеплением его в виде тиазолинона [4, 75, 84]. Этот подход отличается от метода Эдмана и реагентом, используемым па стадии конденсации, и механизмом реакции. Кроме того, на стадии отщепления производного аминокислоты вместо 2-апилипотиазолинона образуется 2-алкил- или 2-арил-тиазолинон. Образование этих производных имеет несколько дополнительных преимуществ. Более слабый электронооттяги-вающий характер алкилыюй или арилыюй групп делает тио-карбонильный атом серы более нуклеофильным. Поэтому циклизация (и отщепление) происходит в менее жестких условиях. Отщепление пои помощи ТФУ завершается при комнатной температуре в течение 20 мин [4, 84]. При повышении температуры реакции можно использовать более слабые кислоты или разбавленную ТФУ. Таким образом, возможно, удастся снизить остроту многих проблем, возникающих на стадии кислотного отщепления в реакции Эдмана: расщепление пептидной цепи, дегидратация Ser, Thr, образование сукцинимида из остатка Asn, окисление Тгр, циклизации N-концевого Gin в пи-роглутаминовую кислоту. Следует отметить, что указанные тиазолиноны более устойчивы, чем соответствующие промежуточные продукты реакций Эдмана, и они не могут изомеризо-ваться в тиогидаитоины. Это важное обстоятельство должно способствовать значительному увеличению выходов в альтер-

16.2. ТВЕРДОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

453

Таблица 16.1. Тиоацилирующие реагенты (общая формула RC(:S)—X), используемые для последовательного

расщепления пептидов № рсагента Заместитель R Уходящая группа X Литература

1 2 3 4 5 6 у 8 9 10 11 12 Фенил Фенил Фенил Фенил Фенил п-Нитрофенил Метил Метил Метил Этил Пропил Пзопропил —sch2coo- -sch2cn —СН2ОСН3 4-Нитрофенолят Сукцинимидил —och2ch2n+(ch3)3 —sch2coo- —SCH2CH3 -sch3 —sch3 —sch3 -sch3 4 84 84 49 19 7 74, 29 29 80, 81, 83 86 86 86

нативных реакциях превращения, дающих продукты, подлежащие идентификации.

Для успешного применения этого подхода к анализу последовательности аминокислот необходимо найти такие тиоацилирующие агенты и условия проведения процесса, которые по своей эффективности на стадии конденсации с пептидом не уступали бы ФИТЦ. Использовались реагенты общего вида RC(:S)—X, где R— алкильный или арильный (ароматический компонент), X — активирующая уходящая группа, например —SR', —QR', —NРеакционная способность простых алкилкарбодитионатов (соединения 8—12) очень мала, что делает их практически непригодными для использования, за исключением реакций, проводимых в присутствии катализаторов общего основного типа

454

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

(например, ацетата триэтиламмония) в сильнополярных растворителях [83]. Катализ в реакции тиоацилирования может быть внутримолекулярным, как в случае аминолиза холиново-го эфира л*-нитробензойной кислоты [7] (табл. 16.1, соединение 6). Этот реагент необыкновенно устойчив к гидролизу. Циа-нометиловые дитиоэфиры (например, соединение 2) достаточно реакционноспособны [84], но уходящая отщепляемая группа полимеризуется, что приводит к образованию осадков, от которых трудно избавиться. Недавно был описан легко синтезируемый реагент (соединение 5) [19].

Известен вариант автоматического ТФ-анализа, основанный на реакции тиоацилирования [29, 70, 75]. В ходе определения структуры В-цепи инсулина при помощи тиоацетилтиогликоле-вой кислоты (соединение 7) были успешно идентифицированы 26 аминокислотных остатков; для нескольких белков удалось определить последовательность протяженностью до 40 аминокислот. Постадийные выходы составляли >95%. Идентификацию отщепленных остатков проводили после превращения АТЗ в тиоациламииокислоты или после обратного гидролиза в исходные аминокислоты. Известен вариант быстрой конверсии 2-фенилтиазолинона в метиламид тиобензоиламинокислоты избытком метиламина. Это «мягкое» превращение в будущем может играть важную роль в отщеплениях, проводимых с участием тиоацилирующих реагентов. 2-Фенилтиазолиноны идентифицированы масс-спектрометрически [5]. Эти соединения также превращали в анилиды тиобензоиламинокислот и идентифицировали методом ТСХ [6], однако такой вариант аминолиза проходит медленнее, чем аналогичная реакция с метиламином.

16.2.5.2. С-концевое отщепление. Предложен ряд методов последовательного химического расщепления по карбоксильному концу молекулы пептида (гл. 18). Первые попытки в этом направлении были предприняты еще до описания реакции Эдмана, но они не смогли составить конкуренцию последней. В перспективном, тщательно изученном методе [98] С-концевой карбоксил пептида реагирует с тиоцианатом аммония в уксусном ангидриде: полученный при этом циклический пептидилтиоги-дантоин обрабатывается кислотой (или ацетогидроксаматом); продуктами последней реакции являются тиогидаптоин С-кон-цевого остатка и пептид, укороченный на одну С-концевую аминокислоту. В исходной методике каждый цикл отщепления включал длительные и трудоемкие стадии разделения и сушки. Удавалось отщепить только 2—6 остатков. Однако в связи с развитием ТФ-метода с этим подходом связаны новые надеж-

16.2. ТВЕРДОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

455

ды [26, 27, 58]. В цитированных работах сделан общий обзор методов С-концевого анализа.

ТФ-подход значительно стимулировал развитие работ по тиоцианатному расщеплению, хотя до сих пор не удавалось отщепить более 6 аминокислот. Особые сложности возникают при анализе как самих остатков Asn, Asp, Glu, Pro, так и остатков, следующих за ними. Pro отщепляется на первой же операции «своего» цикла отщепления (обработка тиоцианатом аммония), поэтому вместе с ним в продуктах того же цикла появляется следующая аминокислота [58]. Отщепление других вышеприведенных аминокислот происходит с низкими выходами. Идентификацию тиогидантоинов проводили различными методами без использования преимуществ высокочувствительной фотометрии. Трудно оценить возможность определения длинных участков последовательности без проведения дополнительной вдумчивой и систематической работы. Мы надеемся, что подобное исследование будет продолжено, так как С-концевые отщепления могут очень полезно дополнять анализ N-концевой последовательности. Кроме того, количественное присоединение пептидов по сс-аминогруппе к нерастворимому носителю происходит в целом значительно легче, чем конденсация по С-конце-вому карбоксилу.

Предлагались иные подходы к определению С-концевой последовательности в комбинации с ТФ-методом. Пептид присоединяли с помощью карбодиимида к S-алкилтиурониевой соли, затем отщепляли С-концевой остаток в виде иминогидантоина водным раствором основания при рН 10—11,5. Таким путем определяли до пяти С-концевых аминокислот коротких пептидов. Преимущество этого метода перед тиоцианатным заключается в том, что он проводится в более мягких условиях, а недостатком является невозможность отщепления С-концевого Pro; при наличии в этом же положении Asp или Glu последние склонны к образованию циклических ангидридов при конденсации с участием карбодиимида [99].

Недавно сообщалось о новых возможностях проведения С-концевого анализа на нерастворимых носителях. Показано, что сложноэфирную связь можно циклизовать в ^С-концевой алкоксазол при помощи сильных дегидратирующих агентов [83]. Последующая обработка спиртом в кислой среде дает сложный эфир аминокислоты. Существует другая, отличная от этого подхода схема анализа последовательности с использованием нескольких новых синтетических реагентов [68]. Оба этих подхода, существующие пока только в виде лабораторных разработок; они интересны для творчески мыслящего химика тем, что открывают новые пути к большой цели.

456

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

16.3. Автоматический жидкофазный анализ. Усовершенствованные методики

16.3.1. Анализ белков и больших пептидов на обычном уровне

Два главных препятствия до сих пор ограничивают пределы возможностей автоматического ЖФ-метода Эдмана [32]. Первой проблемой является перенос остаточных аминокислот на каждый последующий цикл. Это явление происходит как из-за неполного присоединения реагента к белку, так и из-за неполного отщепления модифицированной N-коицевой аминокислоты в виде 2-анилинотиазолинона; другая проблема заключается в том, что па стадии кислотной обработки карбамоилпеп-тида (белка) происходит расщепление внутренних неустойчивых пептидных связей, приводящее к появлению новых полипептидных цепей, т. е. новых последовательностей. В результате этих двух процессов накопление фона ФТГ-аминокислот достигает такого уровня, что однозначная идентификация последовательности аминокислот основной цепи становится невозможной. Для снижения уровня остаточных пиков было предложено проводить и конденсацию, и отщепление АТЗ дважды в каждом цикле [31]. Однако такое изменение стандартной методики приводит к большим потерям пептида (вымывание из реактора). Для снижения этих потерь в реактор добавляют носители— белки или органические полимеры [78, 92], но, к сожалению, белки подвержены ацидолизу, в результате чего возникают ложные последовательности. Для снижения уровня остаточных аминокислот, появляющихся в результате неполного взаимодействия ФИТЦ с полипептидами (особенно если Pro—N-концевой остаток), повышают температуру реактора до 55°С [94].

Предполагалось, что изменение порядка добавления ФИТЦ и буфера в реактор снизит степень расщепления внутренних пептидных связей [102], так как расщепление связей происходит предположительно в основном из-за N—Ю-ацильной миграции, в ходе которой гидроксильные группы Ser атакуют пептидные связи, образуемые аминогруппами Ser. Миграция обратима в щелочных условиях, поэтому в отсутствие ФИТЦ конкурирующее тиокарбамоилирование исключается. Это изменение методики не дало ожидаемого эффекта, так как ФИТЦ и гептан не смешиваются с квадрольным буфером. Другой способ снижения уровня расщепления внутренних пептидных связей заключается в регулировании содержания воды в гепта-фторомасляной кислоте, используемой для отщепления. Высокое содержание воды способствует гидролизу пептидных свя-

16.3. АВТОМАТИЧЕСКИЙ ЖИДКОФАЗНЫИ АНАЛИЗ

457

зей; в то же время при низком содержании воды в кислоте ( — 0,01%) уровень расщепления снижается [11]. Сочетание этого подхода с использованием различных буферов на стадии карбамоилирования (например, Ы,Ы,Ы/,Ы/-тетракис(2-гидрокси-этил)этилендиамин вместо квадрола) позволяет проводить автоматический анализ с постадийным выходом, превышающим 98% [10].

Значительное увеличение возможностей прибора (анализ последовательности 60—70 аминокислот) было достигнуто за счет модификации стандартного прибора (большой объем реактора, увеличение скорости вращения реактора до 1800— 3600 об/мин, охлаждаемая ловушка, соединенная с высоковакуумным насосом) [34].

16.3.2. Анализ последовательности аминокислот небольших и гидрофобных пептидов

Общеизвестно, что автоматический анализ таких объектов часто оканчивается неудачно из-за вымывания пептида при экстракции реакционной массы растворителями и остаточными количествами реагентов. Поскольку наибольшие потери происходят при промывании реактора этилацетатом, удаляющем квадрол, было предложено заменить квадрол летучим буфером, удаляемым испарением в вакууме, и тем самым исключить из программы этилацетатную промывку [77]. Для анализа полной аминокислотной последовательности неполярных пептидов требуются дополнительные изменения как в методике, так и в программе отщепления.

Пептиды, содержащие С-концевые остатки Lys или S-ами-ноэтил цистеина, модифицировали 4-сульфофенилизотиоци-анатом для увеличения гидрофилыюсти пептида [16, 52].

Этот реагент присоединяется как к N-концевой а-амипогруп-пе, так и к аминогруппам боковых цепей упомянутых аминокислот. При обработке кислотой отщепляется первый остаток, а второй готов к участию в обычной реакции Эдмана; сульфо-фенилтиокарбамоильная группа, присоединившаяся к боковой цепи С-концевой аминокислоты, остается неотщепленной. Единственный недостаток этой методики заключается, в неполном отщеплении первого остатка, что сильно снижает начальный выход и вносит высокий фон остаточных аминокислот в самом начале анализа. Кроме того, идентификация первой аминокислоты представляет некоторую трудность. Сообщалось, что изомер (3-сульфофенилизотиоцианат) обладает некоторыми преимуществами при проведении этой модификации [30], однако до сих пор мало известно о его использовании. Для увеличения гидрофильности пептида можно амидировать карбоксильные

458

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

группы боковых цепей 2-амино-1,5-дисульфонатом [

страница 71
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
бутсы купить в интернет магазине
дверная ручка
гастроли дианы арбениной 2017
http://www.prokatmedia.ru/notebook.html

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.09.2017)