химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

димой скорости реакции карбодиимиды и активирующие добавки должны присутствовать в большом избытке, но при этом они могут реагировать, друг с другом, давая нежелательные побочные продукты, что наблюдалось в случае совместного использования дициклогек-силкарбодиимида (ДЦК) [38, 69] и N-гидроксисукцинимида [55].

В последнее время в пептидном синтезе стали использовать новый активатор — 1Ч-гидрокси-5-нонборнен-2Д-дикарбокси-имид, который оказался очень устойчивым в присутствии ди*

446

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

циклогексилкарбодиимида (ДЦК) [37]. Этот активатор может быть с успехом использован в ТФ-присоединениях; в дополнение ко всему сказанному он растворим как в воде, так и в органических растворителях.

Недавно предложен простой и удобный метод активации карбоксильной группы пептида перед его иммобилизацией. При растворении и выдерживании пептида в смеси ТФУ и ангидрида ТФУ, по-видимому, образуется смешанный ангидрид. Затем удаляют легколетучие соединения. Активированный пептид растворяют в ДМФА, добавляют аминокислоту. Предварительное растворение образца в ТФУ облегчает последующее растворение в ДМФА [70]. Выходы стадии присоединения малых и средних по размерам пептидов колеблются от 55% до 98%; высокие выходы свидетельствуют о том, что трифтороацетильная группа является легко уходящей [66]. При обработке пептидов, содержащих Gin, может произойти частичное дезамидирование последнего, а в случае пептидов, содержащих Asp, возможно 'Образование циклических имидов. Вышеуказанные проблемы можно сделать менее острыми, если найти способ активации только части карбоксильных групп. Возможно, затем удастся провести селективную активацию С-концевых остатков с образованием промежуточных оксазолинонов.

Для усовершенствования ДИТЦ-метода присоединения лизилсодержащих триптических пептидов предложен гетероби-функциональный реагент, лактон м-изотиоциаиатобензоил-ол-гомосерипа [40, 101]. Сначала аминогруппы пептида реагируют с группами N=C —S реагента. Обработка полученного соединения ТФУ ведет к образованию лактона и укороченного на одну аминокислоту пептида со свободной N-концевой аминогруппой. Затем пептид конденсируют с носителем, содержащим аминогруппу; при этом лактон, оставшийся присоединенным к боковой цепи остатка Lys, реагирует с аминогруппами носителя. Активация пептида в виде соединения, имеющего лактон-ный фрагмент, оказалась высокоэффективным средством увеличения выхода на стадии присоединения пептида [45]. Не требуется большого избытка реагента, обычно применяемого для предотвращения поперечного сшивания пептида, так как две группы реагента сильно различаются по реакционной способности.

Пептиды можно присоединить к носителю в два приема — сначала высокоэффективным, хорошо отработанным методом «пришить» его к носителю временной связью, потом жестко присоединить требуемой связью за счет внутримолекулярной реакции. Например, пептиды, не содержащие Lys, присоединяли к носителю сначала за а-аминогруппу при помощи ДИТЦ, затем за карбоксильную группу посредством обычно менее эф-

16.2. ТВЕРДОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

447

фективной карбодиимидной конденсации [90]. Предварительное временное присоединение сильно повысило эффективную концентрацию пептида на поверхности носителя, что увеличило выход второго присоединения. Последующая обработка ТФУ вызывает отщепление N-концевой аминокислоты; полученный укороченный пептид готов к определению последовательности. Истинно внутримолекулярный механизм присоединения был использован в работе [105], где применялся предложенный ранее метод четырехкомпонентной конденсации [104]. Оба упомянутых подхода по глубине замысла являются наиболее развитыми и обладают многообещающим потенциалом.

Во внутримолекулярном «содействии» реакции присоединения могут участвовать и нуклеофильные группы носителя. Этим может объясняться повышенная реакционная способность 1,2-диаминов по сравнению с моноаминами [45]. Например, матрицы, несущие этилендиамин или триэтилентетрамин (ТЕТА), являются по отношению к лактону гомосерина более реакционноспособными, чем со-алкиламины. Поэтому при выборе метода конденсации пептида следует учитывать характер нуклеофильных групп носителей, подбирая их таким образом, чтобы при использовании данного метода активации карбоксильных групп присоединение прошло эффективно.

Избыток неиспользованных аминогрупп носителя может вызвать осложнения. Если после присоединения пептида эти группы остаются немодифицированными, то они будут карбамоили-рованы на первой же стадии реакции Эдмана. По нашим данным, это приводит к ухудшению результатов отщепления и высокому уровню фона [64]. При использовании МИТЦ вместо ФИТЦ на первом цикле отщепления значительно увеличивается выход отщепленных аминокислот и снижается уровень фона. Для успешного определения последовательности на микроуровне очень важно найти еще более эффективный реагент для «забивки» остаточных аминогрупп носителя. При этом реагент не должен необратимо блокировать аминогруппу N-концевой аминокислоты или изменять строение боковых цепей аминокислот. Если N-концевая аминогруппа пептида предварительно защищена БОК или другой легкоудаляемой группой, то эффективным методом «забивки» может быть ацетилирование избытка реакционноспособных аминогрупп носителя мягкими реагентами— сложными эфирами уксусной кислоты. После присоединения БОК пептидов к макропористым полистирольным смолам мы обрабатываем носитель метилацетимидатом (G. С. DuBois, V. Alvarez, Е. Apella, неопубликованные данные). Положительно заряженные амидиновые группы, появляющиеся на смоле после «забивки», возможно, увеличивают гидрофильность и сольватацию носителя. В целом операция «забивки» позволяет

448

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

улучшить структуру поверхности носителя.

Однако планируя и проводя такую обработку поверхности, надо предусматривать и исключать возможность последующих побочных реакций между функциональными группами модифицирующего агента и присоединенным пептидом, которые приводят к падению выходов при определении последовательности я возрастанию уровня фона.

16.2.4. Отщепление по Эдману

Предварительное расщепление пептидов, присоединенных к ТФ-носителям, проводится почти исключительно по методу Эд-мана с применением реагентов и условий, аналогичных таковым для ЖФ-анализа. Обсуждение этих методик читатель может найти в литературе, относящейся к разд. 16.2.1.

Главное преимущество химии ТФ-анализа заключается в гибкости выбора буферов, растворителей, режимов промывок, реагентов, различных добавок, температуры. Потери образца с экстракциями, а также летучесть или растворимость вещества в ходе анализа налагают очень незначительные ограничения па рабочие параметры, за исключением тех случаев, когда пептиды присоединены адсорбционными связями или когда реакции проводят в газотвердофазной системе.

При работе и ЖФ- и ТФ-методами следует предъявлять одинаково высокие требования к чистоте используемых реактивов и растворителей. Нельзя полностью исключить присутствие вредных примесей и протекания побочных реакций, но их влияние значительно снижается при использовании минимальных объемов и концентраций реагентов. ТФ-реакции можно проводить в постоянном потоке свежих реагентов с удалением побочных продуктов; это преимущество легко реализовать в ми-ниатюризованных системах, где перенос тепла (при предварительном подогреве реагентов) не представляет проблемы.

16.2АЛ. Реакции присоединения реагента. В этой реакции образования фенил тиокарбамоил пептидов (ФТК-пептидов) или их аналогов буферы не играют никакой роли в образовании пленки и удержании пептида; в ходе реакции высвобождается или потребляется очень мало водородных ионов, и поэтому ее можно проводить, используя очень низкие концентрации буфера. Представляется заманчивым увеличить эффективность взаимодействия реагента с полипептидом путем использования различных добавок (денатурирующие вещества, катализаторы реакции, поглотители примесей), однако при введении этих новшеств следует взвешивать возможность появления побоч'

16.2. ТВЕРДОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

449

ных процессов. Поглотители (например, первичные амины), используемые в молярных концентрациях, превышающих концентрации пептидов (но не изотиоцианата), могут быть полезны в анализе и на микроуровне, так как с их помощью можно удалить альдегиды и другие высокоактивные примеси. Верхний предел концентрации аминов определяется еще и тем, что их присутствие не должно вызывать побочных реакций, подобных тем, что происходят после «забивки» ФТК-группами поверхности носителя.

Правильный выбор реагента для реакции — принципиальное условие успеха. Выбор водных сред вместо неводных частично вызван необходимостью сольватации присоединенных пептидов, имеющих разный состав. Вода облегчает сольватацию, но она же вызывает гидролиз изотиоцианата, приводящий к последующим побочным реакциям. При решении этого вопроса следует непредубежденно относиться к новым предложениям.

16.2.4.2. Реакции отщепления. ТФУ оказалась наилучшим из отщепляющих агентов, найденных до сих пор. Ее легче очищать, чем более высокомолекулярные перфторокислоты, а ее летучесть оказывается преимуществом при получении и превращениях отщепленных продуктов (анилинотиазолинонов, АТЗ).

В принципе можно использовать и другие сильные кислоты, например BF3. Решающим доводом «за» или «против» использования того или иного метода отщепления может служить выход Ser в виде ФТГ или другого производного, пригодного для идентификации.

В ТФ-методе тиазолинон аминокислоты (АТЗ) обычно смывают с колонки той же кислотой, которой проводят отщепление АТЗ. Поскольку ТФУ — сильный элюирующий растворитель, то на этой стадии цикла она смывает со смолы многие адсорбированные вещества, которые оказываются в растворе вместе с АТЗ и загрязняют его.

При малых размерах реакционной колонки собранные АТЗ нетрудно охладить сразу после их образования и тем самым предохранить от разрушения. Отщепление обычно проводят при повышенных температурах в течение времени, достаточного для получения наиболее трудно отщепляемых остатков (например, Pro [15, 41]). В другом варианте можно проводить циклизацию и отщепление парами кислоты, действующими на сухой связанный пептид [42, 56]. После вытеснения паров кислоты инертным газом АТЗ можно смыть растворителем с меньшей элюирующей способностью, чем ТФУ, и поэтому в растворе будет меньше загрязняющих примесей.

Отщепление АТЗ кислотой следует заканчивать до начала их элюирования с колонки (или проводить отщепление в несколь-

29 -703

450

IG. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

ко приемов с промежуточными высушиваниями колонки). При этом высокореакционноспособные АТЗ концентрируются на поверхности носителя при повышенной температуре. Так как при выдерживании в этих условиях они склонны к разрушению, то при выборе режима отщепления АТЗ следует опираться на тщательный контроль условий эксперимента.

Необходимо контролировать содержание воды в ТФУ. Если кислота содержит слишком мало воды, то она находится в равновесии с небольшим количеством трифтороуксусного ангидрида. Последний может реагировать с ФТК-пептидом, давая нерастворимый побочный продукт [8]. Ангидрид может удерживаться адсорбционными силами на поверхности носителя при помощи потенциально реакционноспособных трифтороацетиль-ных производных различных структурных элементов носителя (например, ОН- и NH-rpynn [91]). Эти производные при добавлении буфера (на стадии присоединения реагента в следующем цикле) блокируют N-копцевую аминокислоту пептида.

В то же время слишком высокое содержание воды в ТФУ приводит к недопустимо высокому уровню расщепления внутренних пептидных связей и снижает скорость отщепления АТЗ. До сих пор неясно, какое содержание воды следует считать разумным компромиссом. Необходима разработка удобных и надежных методов определения содержания воды в ТФУ.

16.2.4.3. Реакции превращения. Аминокислоты, отщепленные ТФ-методом в виде АТЗ, обычно превращают в ФТГ-производные аминокислот теми же способами, что и в ЖФ-анализе. Некоторые из последних результатов в обнаружении и количественном определении ФТГ-производных аминокислот приведены в разд. 16.3.3. Недавно была предложена новая реакция превращения, использованная и в ТФ, и в ручном варианте определения— быстрый аминолиз тиазолинонов (в сухом состоянии или в растворе) первичными алкиламинами, дающими ал-киламиды ФТК-аминокислот [1, 50, 51, 57]. Эти реакции нетребуют нагревания или экстракции. По окончании реакции избыток амина удаляется в потоке азота. По своему хроматогра-фическому поведению и поглощению в УФ-области спектра ал-киламиды подобны ФТГ-аминокислотам. Детали методики изложены в работе [51]. Несколько интересных реакций конверсии кратко описаны в сообщении [81]. 5-Метилтиазолиноны (МТА) можно О-ацетилировать уксусным ангидридом и затем идентифицировать полученные производные методом ГЖХ. МТА можно расщепить водным аммиаком и получить амиды исходных аминокислот.

16.2.4.4. Идентификация и количественный анализ. Чувствительность процесса определения последовательности можно уве-

16.2. ТВЕРДОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

451

личить, используя на стадии присоединения модифицированные реагенты. В данной главе не рассматриваются методы, связанные с использованием радиоактивных меток или интенсивно окрашенных изотиоцианатов, так как они с самого начала развивались в рамках методологии ручного или автоматизированного ЖФ-определения последовательности.

Описано использование [355]ФИТЦ в автоматическом ТФ-анализе [17, 18]. Хотя в лучших экспериментах провозглашалась возможность обнаружения пикомольных количеств ФТГ-аминокислот, в повседневной практике определение проводили на уровне ^100 пмоль (Waxdall, частное сообщение). Главными проблемами являются, во-первых, относительно низкий уровень удельной радиоактивности доступного реагента, во-вторых, разбавление реагента в больших полостях реактора и системы подачи реагента в реактор.

Предложена усовершенствованная схема подачи [355]ФИТЦ, [44]. Для резкого уменьшения объема колонки необходимо существенное улучшение свойств ТФ-носителей. Указанные нововведения должны также снизить уровень радиоактивного фона, который становится серьезной проблемой при работе с пи-комольными количествами пептида. Мы полагаем, что в будущем возможности анализа чрезвычайно малых количеств вещества с применением радиоактивных изотиоцианатов окажутся гораздо более благоприятными для ТФ-метода, чем для ЖФ-определений. Чувствительность ТФ-анализа можно существенно увеличить и без применения дорогостоящих и опасных радиоактивно меченных реагентов. Описан ручной ТФ-метод с применением Г\1,М-ди метил аминоазобепзол-4/-изотиоцианата (ДАБИТЦ) [21] (гл. 14). Этот реагент дает интенсивно окрашенные тиогидантоиновые производные (ДАБТГ). Недавно эти производные были разделены, идентифицированы количественно при помощи ВЭЖХ на уровне 5—10 пмоль [24, 107]; ДАБТГ-производные аминокислот поглощают при длине волны 436 нм. Сообщалось об использовании этого метода в автоматическом ТФ-анализе [46]. В каждом цикле

страница 70
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить декоративные дверные ручки кольцо
дешевые ультрабуки
infected rain билеты
дочки-матери

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.08.2017)