химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

5 мг персульфата аммония.

Образцы вносят с помощью микрошприца или микропипетки. Электрофорез проводят при 100 В до прохождения зоной красителя формирующего геля, а затем при 200 В до приближения зоны красителя к нижней границе геля.

Двумерный электрофорез. Проводят электрофорез в первом направлении при рП 8,9 (или ином рН) в присутствии 8 М мочевины, а затем во втором направлении в присутствии ДСН. С целью сужения зон на границе геля электрофорез во втором направлении проводят в ступенчатой буферной системе. Гель из трубки помещают па слон формирующего геля в торец пластины и фиксируют с помощью агарозы (концентрация ДСН и буфере для образца 1% (масс/об.), см. разд. 1.3.1) [115]. Электрофорез во втором направлении можно вести в непрерывной буферной системе на градиентном геле, тогда сужение зон будет идти вблизи стационарного положения. В этом случае гель из трубки (диаметр 3,5 мм) уравновешивают в течение 30 мин с 100 мл электродного буфера (0,025 М фосфат, рН 7 + + 0,15% ДСН) и помещают па верхний торец готовой (фирменной) пластины градиентного геля (4—27%) (разд. 1.3.1.1), которую предварительно пропитывают ДСН с помощью электрофореза при 50 мА в течение 3 ч. Разделение проводят при 30 мА в течение 15 мин и 50 мА в течение 3,5 ч [114].

1.3.2.4. Изоэлектрофокусирование. При изоэлектрофокусирова-нии раствор, содержащий смесь амфолитов-посителей (алифатических полиаминополикарбоиовых кислот), подвергают воздействию электрического поля. При этом различные компоненты смеси мигрируют в ту область, где их суммарный заряд равен пулю, т. е. вещества с низкими изоэлектрическими точками двигаются в направлении анода. В результате между электродами формируется градиент рН. Амфолиты-носители выпускаются рядом фирм (LKB, Serva, Rio-Rad, Pharmacia, Pierce). Если в систему с градиентом рН, сформированным амфолита-ми, вносят белок, то образец мигрирует под воздействием поля в зону, соответствующую его изоэлектрической точке. Изофо-кусировапие позволяет наиболее точно оценить гетерогенность белков по заряду. Причину гетерогенности по заряду, о чем свидетельствует множество зон, выявить нелегко. Гетерогенность может быть обусловлена наличием в образце примесей других белков, химической модификацией белковых молекул вследствие дезамидирования, различной степенью фосфорилирования или взаимодействием цианата с N-концевой аминогруппой или

46

t. определение состава вилковых олпромеров

е-аминогруппой остатков лизина. Следовательно, предварительно необходимо охарактеризовать белок электрофоретичеекп, а затем изучать с помощью изоэлектрофокусирования. Установлено, что из 500 исследованных белков 70% имеют изоэлектри-ческие точки в кислой области, а 38%—в области рН 4,5—6,0 [63].

Аналитическое изоэлектрофокусирование в присутствии 8 \\ мочевины можно проводить в обычных гелях — полиакриламид-пом или сефадексе. Препаративное изоэлектрофокусирование проводят в колонках в градиенте плотности (сахарозы), однако в последние годы предпочтение отдают разделению в слое сефа-декса или другого носителя (методики эксперимента описаны в буклетах фирм LKB, Pharmacia).

Вначале проводят изоэлектрофокусирование в широком диапазоне рН (например, 3-ИО), затем вторично — в более узком диапазоне (рН 5—7). Амфолиты-носители имеют высокую стоимость, поэтому в целях экономии разделение можно проводи п> вначале в трубках, а после тщательного подбора условий выполнять препаративное разделение.

Аналитическое изоэлектрофокусирование. Для приготовления 10 мл рабочего буфера смешивают 1,65 мл запасного раствора (30%-ного акриламида), 4,8 г мочевины, 3,75 мл воды, 1,0 мл раствора амфолитов, 5 мг персульфата аммония. Анодный буфер имеет состав: 0,03 М фосфорная кислота + 8 М мочевина; катодный буфер — 0,05 М NaOH+ 8 М мочевина. Образец растворяют в буфере следующего состава: 1) 0,03 М фосфорная кислота + 8 М мочевина + 20%-ный глицерин (рН 4,0) или 2) 0,05 М трис+ 8 М мочевина+ 20%-ный глицерин (рН 8,0) (первый — в кислой и второй — в основной зоне геля). Проводят предварительное изоэлектрофокусирование при 400 В в течение 2 ч, наносят образцы, проводят разделение при 400 В в течение 17 ч. Гель промывают 10%-ной трихлороуксусной кислотой для удаления амфолитов, а затем проводят проявление (окрашивание). Проявление можно проводить прямым способом. Для этого гель пропитывают в течение 3 ч раствором следующего состава: 25%-ный этанол + 10%-ная уксусная кислота+ 0,1 %-ный сульфат меди + 0,01 %-ный кумасси голубой R-250; раствор для обесцвечивания: 10%-пый этанол + 10%-ная уксусная кислота [144].

Градиент рН измеряют на неокрашенном геле с помощью контактного электрода (тип LoT 403-30, фирма Ingold). Отрезки проволоки вводят в гели с интервалом 1 см, измеряют рН, гель окрашивают и фотографируют [116]. Измерения проводят по крайней мере на трех гелях, из трех измерений находят среднее. Полученные значения изоэлектрических точек служат характеристикой белка в среде 8 М мочевины. Последнее замечание

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

47

существенно, поскольку присутствие мочевины влияет на рК ионогенных групп [28, 176].

Молекулярные массы компонентов смеси можно определить с помощью двумерного электрофореза [128] по методике, описанной в разд. 1.3.2.3.

Препаративное изоэлектрофокусированис. Установка для электрофокусирования должна обязательно включать эффективно охлаждаемую горизонтальную пластину, электродные сосуды, источник mn апия.

15 I' улырадскса или сефадекса 1EF (сефадекс G-75 после специальной oopaooiки) выдерживают до полного набухания в 225 мл раствора 8 М мочевины, прибавляют 12 мл раствора амфолиюв и тщательно перемешивают. Затем суспензию деаэрируют и помещают в специальную кювету (например, размером 200x200x5,0 мм) в охлаждаемом блоке, выравнивают суспензию стеклянной палочкой. Избыток влаги удаляют путем ос i ест венного испарения пли поглощают сухим сефадексом (открытую склянку с сефадексом накрывают марлей и фиксируют с помощью клейкой лепты па поверхности влажной суспензии). Подготовленный таким образом слой влажного геля при наклоне кюветы па 45 °С не должен смещаться.

Образец либо непосредственно наносят па поверхность геля (в виде полоски), либо после смешивания с сухим сефадексом (1 мл раствора образца в 8 М мочевине па 60 мг сефадекса) помещают в канавку, специально вырезанную в слое геля. Наносить образец можно в любой зоне рН-градиепта, нагрузка составляет 1 мг белка па 1 мл суспензии геля.

Контакт слоя геля с электродным буфером осуществляется с помощью полосок бумаги ватман ЗММ, завернутых в целлофан или диализную пленку. В зависимости от расстояния между электродами и эффективности охлаждения электрофорез проводят при 300 В в течение 16 ч, а затем при 600 В в течение 4 ч. Белковые зоны обнаруживают методом отпечатков; для этой цели лист ватмана ЗММ помещают па слой геля и прикатывают роликом. Спустя две минуты лист бумаги снимают, высушивают, дважды промывают (10 мин) 10%-ной трихлор-уксусной кислотой для удаления амфолитов, промывают (5 мин) раствором для обесцвечивания с целью удаления трихлоруксусной кислоты, окрашивают кумасси голубым G-250 (разд. 1.2.1.1) (10 мин) и обесцвечивают.

Зоны, содержащие исследуемые белки, извлекают, переносят в небольшую колонку (например, небольшой шприц с кусочком стекловаты), суспендируют в буфере. Амфолиты отделяют диализом или гель-фильтрацией на сефадексе G-10.

Иногда примеси амфолитов удаляются с трудом и мешают биологическому тестированию. В таких случаях следует испы-

48

I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛПГОМЕРОВ

тать систему буффалит (Buffalyie), поставляемую фирмой Pierce [139]. Более детально методика работы обсуждается в ряде публикаций [140, 141] и в буклетах фирм-поставщиков.

1.3.2.5. Фракционное осаждение. Нейтральные соли оказывают специфическое и глубокое воздействие на конформационную стабильность белков [179], причем катионы и анионы, как правило, по-разному влияют на развертывание нативных структур. В то время как в присутствии небольших количеств солей растворимость белков возрастает (так называемый солевой эффект), при высоких концентрациях (обычно несколько молен) имеет место явление высаливания, которое и вызывает осаждение белков. Относительная эффективность нейтральных солей в реакции высаливания впервые была изучена в 1888 г. [79]. Предложены лиотропные ряды катионов и анионов:

Li+Физико-химические основы явления высаливания белков в концентрированных растворах солеи достаточно сложны [163]. Одна из причин высаливания связывается со снижением активности ассоциированных с белком молекул воды, с их более слабым взаимодействием с полярными группами белка. К существенным факторам, определяющим растворимость белка, относят также поверхностное натяжение на границе между белковыми молекулами и па поверхности раздела белок — вода, причем лиотроппый эффект объясняют влиянием посторонних ионов на величину поверхностного натяжения [27]. Растворимость 5 многих белков (при высокой солевой концентрации) уменьшается по мере увеличения концентрации соли по логарифмической зависимости:

где р — растворимость белка в воде (находят обычно путем экстраполяции к со = 0), Ks — константа высаливания, со—ионная сила. Зависимости, приведенные на рис. 1.5, иллюстрируют изменение растворимости ряда белков в растворах сульфата аммония [36]. Как правило, наиболее полное осаждение белка наблюдается вблизи его изоэлектрической точки, однако это выполняется далеко не всегда.

Осаждение сульфатом аммония часто применяется в качестве предварительной стадии очистки белка, например с целью концентрирования или отделения от сопутствующих примесей. Иногда этот прием может оказаться полезным при разделении субъединиц, в частности если они имеют различную растворимость в сульфате аммония (или в растворах других солей).

1.3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОНОМЕРОВ

7 2 3 4

О 2 4 6 8 Ю

Ионная сила

РИС. 1.5. Изменение растворимости белков в растворах сульфата аммония, / — фибриноген; 2 — гемоглобин; 3 — сывороточный альбумин; 4 — миогло-бин [36].

Однако даже в благоприятных случаях осаждение приходится повторять, чтобы уменьшить возможное соосаждение других субъединиц. Сульфат аммония обладает несомненными преимуществами перед другими нейтральными солями: он имеет высокую высаливающую способность, не денатурирует белки, обладает низкой стоимостью и доступен в достаточно очищенной форме, хорошо растворим в воде, при растворении выделяется мало тепла. Кроме того, концентрированные растворы сульфата аммония имеют небольшую вязкость и плотность, что немаловажно, поскольку последующей стадией является ультрацентрифугирование.

На практике для достижения оптимальных результатов приходится действовать методом проб и ошибок. Вначале строят градуировочный график в определенной области концентраций сульфата аммония с учетом того, что сульфат аммония несколько снижает рН незабуференных растворов. Величина «процента насыщения» (100%-ное насыщение соответствует 4,05 М раствору при 20 °С), характеризующая поведение конкретного белка, сильно варьирует в зависимости от свойств белка, его концентрации, рН (обычно рН 5,5—7,5) и температуры раствора (обычно 20 °С). При приготовлении растворов сульфата аммония можно руководствоваться номограммой, приведенной в работе [48]. По номограмме легко определить количество соли, которое необходимо прибавить к определенному объему раствора для достижения нужной степени насыщения. В области рН<5 удается проводить осаждение белков при более низких концентрациях соли (такие растворы имеют более низкую плотность, что улучшает условия разделения фаз при центрифугировании).

4-703

50

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОСТАВА БЕЛКОВЫХ ОЛИГОМЕРОВ

Разделение с помощью органических растворителей. Белки можно фракционировать с помощью осаждения органическими растворителями, например этанолом, ацетоном. Белки, склонные к агрегации, осаждают сульфатом аммония в присутствии про-панола [51]. Органические растворители снижают растворимость белков благодаря изменению диэлектрической проницаемости среды. Поскольку причина осаждения состоит в агрегации молекул вследствие электростатического взаимодействия, что аналогично осаждению в изоэлектрической точке, рН в данном случае более важный фактор, чем при осаждении солями. Следовательно, с помощью органических растворителей можно разделить очень близкие в структурном отношении белки, имеющие разные изоэлектрические точки. Например, при рН 6,5 парваль-бумины II, III и IV были разделены путем осаждения ацетоном [163]. Белок IV выпадал в осадок при концентрации ацетона 55—60%, белки III и IV — при концентрации 60—65%, белки III и II — при концентрации 65—70%, наиболее кислотные ком-копепты смеси с изоточками р/С — 4 выпадали в осадок при концентрации ацетона 70—80%.

Как правило, чем ниже молекулярная масса белка, тем выше концентрация органического растворителя, необходимая для его осаждения. Если концентрация растворителя слишком велика, осаждение может быть затруднено из-за белок-белкового взаимодействия. В этом случае в раствор добавляют биполярные вещества, например глицин, которые выполняют роль буфера и стабилизируют диэлектрическую проницаемость. Если белок денатурирует при комнатной температуре, осаждение проводят при пониженной температуре (при 0°С). Прибавление к раствору белка органического растворителя вначале вызывает постепенное повышение температуры (до достижения 20%-ной (об./об.) концентрации), иногда уменьшение объема. Важно в процессе осаждения поддерживать постоянную температуру раствора, поскольку растворимость белков сильно снижается при охлаждении.

В этом отношении осаждение органическими растворителями отличается от фракционирования с помощью солен, при котором зависимость растворимости от температуры не столь однозначна.

1.3.2.6. Прочие методы разделения. Здесь следует назвать прежде всего аффинную хроматографию, которая обсуждается в гл. 5.

1.4. Стехиометрическое соотношение мономеров в олигомере

Для определения стехиометрического содержания мономеров в олигомерных белках используется ряд методов. Выбор метода анализа определяется как особенностями состава олигомера,

1.4. СООТНОШЕНИЕ МОНОМЕРОВ В ОЛИГОМЕРЕ 51

так и техническими возможностями исследователя. Ввиду трудоемкости многих методов и недостаточной достоверности получаемых таким образом результатов при анализе состава оли-гомера надо сопоставлять данные разных методов. Часто соотношение мономеров рассчитывают на основании молекулярных масс интактиого олигомера и составляющих его мономеров. Все более широкое применение находит модификация субъединиц путем сшивания бифункциональными реагентами. С целью получения гибридных олигомеров, которые затем исследуют методом электрофореза в ПААГ, проводят конденсацию мономеров, выделенных из других биологических видов или предварительно модифицированных химическими реагентами. Применение таких искусственных приемов, как получение гибридных олигомеров и сшивания мономеров, обычно ограничено олиго-мерами небольшого размера, включа

страница 7
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы холодильщиков онлайн в краснодаре
мебель для домашнего кинотеатра в квартиру
состав оборудования шкафа асет
комод глубиной 60

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.09.2017)