химический каталог




Практическая химия белка

Автор А.Дарбре

ти исключительно на пептидах, ковалентно присоединенных к модифицированным матрицам одного из трех типов:

1) полистирол (1% поперечной сшивки дивинилбензолом);

2) пористое стекло;

3) производные полиакриламида.

Описаны методы получения и свойства этих носителей [70]. Идеальная матрица, предназначенная для иммобилизации пептидов, должна обладать следующими свойствами:

440

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

1) низким сопротивлением потоку в колонке, что обеспечивается как высокой механической прочностью частиц, так ч минимальным изменением объема носителя в колонке в течение всего цикла отщепления;

2) химической стойкостью;

3) высоким значением удельной поверхности, легко доступной окружающей жидкости;

4) химической емкостью поверхности частиц сорбента, достаточной для эффективного присоединения пептида;

5) кинетические условия реакций пептидил-носителя должны приближаться к кинетике реакций в растворе.

Ни один из известных сегодня носителей не удовлетворяет одновременно всем вышеупомянутым критериям. Слабосши-тые полистирол и полиакриламид должны предварительно хорошо набухнуть в растворителе для того, чтобы функциональные группы носителя или пептида, присоединенного к носителю, были доступны для реагентов. Поэтому при работе с такими сорбентами очень важен выбор растворителей. При смене растворителей часто происходит «усадка» или разбухание этих гелеобразных полимеров, что ведет к образованию каналов или же «запиранию» колонки. Для предотвращения этих явлений частицы пептидил-полимера тщательно смешивают с гораздо большими объемами маленьких стеклянных шариков. Однако увеличение общего объема реакционной массы требует применения большего расхода реагентов и промывающих растворителей, ведет к сорбции реагентов и побочных продуктов реакции. Соответственно возрастает уровень фона в анализируемых образцах, что может стать серьезным препятствием для анализа па микроуровне.

В противоположность этому пористые стекла обладают жесткой структурой и не вносят упомянутых проблем. Поэтому при работе с ними можно применять широкий набор растворителей без риска появления в колонке высокого давления (при условии, что в ходе присоединения пептида удалось избежать механического повреждения хрупких частиц, так как размол крупных частиц до мелких приводит к созданию больших противодавлений при последующей работе колонки).

К сожалению, стекло до некоторой степени растворяется в щелочной среде, поэтому не следует использовать растворы, имеющие pH>8,5-f-9,0.

Несмотря на недостатки, присущие носителям па основе стекла, применение последних позволяет успешно проводить определение последовательности.

Низкосшитый полистирол является неудачной матрицей для пришивки белков и очень больших пептидов. Часто встречающаяся несовместимость растворителей и пептидов (или матри-

16.2. ТВЕРДОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

441

цы) приводит к изменениям структуры пептидилносителя, неблагоприятным для доступа реагентов к N-концевым аминогруппам. Для решения этой проблемы применяли матрицу на основе полиакриловой кислоты, амидированной сульфонирован-ным п-фенилендиамином [20]. Полученные при дальнейшей модификации полимера изотиоцианатные группы используют для присоединения белка, а соседние ионы сульфоната создают местное гидрофильное окружение, необходимое для совместимости с растворителями.

Все обычно применяемые носители имеют элементы структуры, вносящие свой вклад в создание химического фона, и поэтому для снижения уровня фона необходима химическая модификация носителя, Поскольку постадийные выходы редко превышают 95%, то, очевидно, эти структуры вносят* существенный вклад в неидеальную кинетику реакций.

Дальнейшие успехи в создании носителей зависят от уровня понимания природы химических реакций в многофазных системах. Необходимо отказаться от представления о том, что твердый носитель представляет собой инертную «стенку», к которой прикреплен пептид. Исследования в области твердофазного синтеза пептидов в настоящее время опираются на концепцию динамической системы носитель—пептид — растворитель, подчиняющейся различным правилам кинетики и термодинамики [35]. Неидеальная кинетика реакции зависит не столько от замедленной диффузии или массоперепоса внутрь гранулы, сколько от плохой сольватации пептида и матрицы носителя [39]. Возможно, на сольватацию существенно влияет локальное расслаивание вну-Гри фаз. В определенном микроок-ружеиии пептид и матрица могут взаимодействовать настолько сильно, что это взаимодействие становится равнозначным осаждению, приводящему к выводу вещества из реакции.

В других случаях происходит распределение реагентов в системе жидкость — жидкость. По этой причине концентрация реагента в микроокружении N-концевой части пептида особенно мала. Этой проблемы легко избежать, используя систему с одним растворителем [80]. Местные перераспределения, происходящие по любому из вышеупомянутых механизмов, возникают в ходе последовательного отщепления и вызывают временное или постоянное снижение реакционной способности отдельных цепей. Этот недостаток усиливается при наличии заведомых негомогенностей в структуре матрицы (неравномерное распределение поперечных сшивок и т. д.). В результате химической модификации пористого стекла образуется поверхность, покрытая тонкой пленкой поперечно-сшитого силоксанового полимера, а не цепь, присоединенная к сорбенту в одной точке. Поэтому в случае носителей на основе стекла должны сущест-

442

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

вовать те же местные «барьеры» для реакций, что и в гелевых структурах полимеров.

Есть несколько сообщений о получении, свойствах и использовании в твердофазном пептидном синтезе акриловых сополимеров, состоящих главным образом из поли-ГЧ,Ы-диметилакрил-амида [23, 95, 96] или поли->1-акрилпирролидона [93, 97]. Эти полимеры совместимы с гораздо большим числом полярных и умеренно полярных растворителей (и, по-видимому, также с присоединенными пептидами), чем полиакриламидные или по-листирольные носители. Поэтому представляется заманчивым использовать указанные полимеры в качестве носителей для: ТФ-анализа пептидов. Выбирая носитель, мы ориентируемся прежде всего на жесткую конструкцию матрицы, что позволяет избежать серьезных осложнений, связанных с разбуханием сорбента и блокированием колонки. Для того чтобы можно было проводить реакцию присоединения ФИТЦ в силыющелоч-ной среде, мы выбрали вместо стеклянных носителей макропористый полистирол. Дополнительное достоинство полистирола состоит в том, что на нем можно устойчиво и воспроизводимо проводить многочисленные реакции химической модификации. Выяснилось, что эта жесткая, сильносшитая матрица тем не менее обладает некоторой гибкостью на молекулярном уровне и обеспечивает большой набор микроокружений (включая неблагоприятные) в структуре гидрофобных поверхностей.

Нашей первой целью было введение «вставок» («ножек»), выступающих из поверхности с функциональными аминогруппами, необходимыми для последующего присоединения пептидов. Если «вставки» являются полимерами необходимого размера и состава, то они могут служить также сорастворителями и содействовать образованию отделенной от матрицы фазы, в которой совместимы пептид и используемые растворители. В принципе можно найти условия, позволяющие обеспечить и необходимую степень сольватации всех пептидных цепей и требуемую степень взаимодействия последних с реагентами. В качестве пространственно модифицирующего полимера был выбран полиэтиленгликоль, найденный опытным путем как со-растворитель при ТФ-анализе [87, 88]. Успешно проведен пептидный синтез с последовательным наращиванием пептидной цепи, присоединенной к концам цепей полиэтиленгликоля [79]. При этом кинетика присоединения схожа с наблюдавшейся в свободном растворе [9].

Производные макропористого полистирола были синтезированы по методике, подробно описанной в работе [51]. Сообщалось о предварительных результатах анализа последовательности [1].

16.2. ТВЕРДОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

443

Обнаружено, что эти носители хорошо проницаемы для растворителей и обладают низким уровнем фона примесей. Однако в ходе последующего сравнительного расщепления по Эдману пептидов, присоединенных к коротким вставкам, и тех же пептидов, «пришитых» к небольшим цепям полиэтиленгликоля (содержащим до 13 оксиэтиленовых звеньев), не было обнаружено значительных различий ни в начальных, ни в постадий-иых выходах ФТГ-производных аминокислот. Мы пришли к выводу, что в данном случае для создания эффекта сораство-рения или предотвращения сильных взаимодействий полистирол — пептид необходимо увеличение либо навески образца, либо молекулярной массы модифицированного полимера.

В заключение следует отметить, что вероятным идеальным носителем может быть такой привитой сополимер, в котором один компонент служит жестким каркасом, поддерживающим структуру второго сополимера, к которому ковалентно присоединен пептид. Полимер с жестким каркасом из-за сложностей, вызываемых характером его поверхности, сам по себе был бы ненадежным «якорем» для конденсации с пептидом. Второй компонент следует выбирать с учетом его совместимости с различными растворителями и реагентами, используемыми как для присоединения пептида, так и для определения строения последнего. Сам по себе этот сольватируемый полимер из-за своей совместимости с растворителями и доступности внутренней структуры был бы по механическим свойствам непригоден для использования в колонке. Суммируя вкратце вышеизложенное, следует сказать, что упомянутая макропористая система *с жестким каркасом является пелликуляриой конструкцией, успешное использование которой зависит от правильного выбора привитого сольватируемого полимера.

16.2.3. Присоединение пептидов к носителям

¦и «забивка» оставшихся реакционных центров носителя

ТФ-подход порождает свои проблемы, возникающие из необходимости фиксировать пептид на носителе (обычно при помощи ковалентных связей). Хотя пептиды можно связать и адсорбционными силами, такая иммобилизация не надежна, так как жидкофазное элюирование, происходящее минимум один ра \ в каждом цикле отщепления аминокислоты, может привести к вымыванию и потере пептида. Для надежной адсорбции необходим тщательный подбор хорошо сочетающихся между собой пептидных образцов и адсорбирующих поверхностей. При множественных и очень прочных адсорбционных связях затрудняется сольватация и понижается подвижность пептидов и тем самым ухудшается кинетика реакции (разд. 16.2.2 — об-

444

16. НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА

суждение носителей). С учетом этих потенциальных недостатков был разработан и успешно использован в миниатюризован-ном секвенаторе носитель, представляющий собой стекловолок-нистый диск, покрытый полибреном [42]. Исследуемый образец адсорбируется на диске (гл. 17). Сообщается об успешном использовании такого носителя при изучении структуры большого числа пептидов и белков (определена последовательность, включающая >30 остатков).

Потеря пептидов сводится к минимуму вследствие их сорбции на большой площади поверхности носителя и использования наиболее полярных реагентов (триметиламин и ТФУ) в газообразном состоянии.

При проведении ковалептного присоединения возникают многочисленные осложнения. Кроме того, не существует удовлетворительного общего способа присоединения пептидов исключительно по их С-концевым остаткам.

В особых случаях можно использовать несколько отлично зарекомендовавших себя вариантов присоединения по а-кар-боксилу, широко применяющихся па практике. Эти частные приемы присоединения, а также несколько общих методов конденсации, но не по концевым аминокислотам, обсуждались в работах [64, 106], а также в данной книге (гл. 12).

Прямое присоединение пептидов к носителю происходит по бимолекулярному механизму. При конденсации очень малых количеств пептида высокий выход реакции возможен только при очень высокой эффективной концентрации нуклеофильных групп носителя (обычно это аминогруппы). Поскольку последние присутствуют в большом молекулярном избытке, то кинетически возможна реакция псевдопервого порядка. Однако концентрация аминогрупп пептида мала, и поэтому не требуется их защита в ходе присоединения (за исключением особых случаев [64]). Аминогруппы следует блокировать в тех случаях, когда перед добавлением носителя пептид предварительно активируется. При одностадийных присоединениях редко нужна защита N-концевых групп. Если же она все-таки необходима, то при помощи 2-гр?Г-бутилоксикарбонилоксиимино-2-фепил-ацетопитрила [1] вводят 2-т/^г-бутилоксикарбонил (БОК) группу [1]. Аналогичная защита аминогруппы нужна и перед активацией карбоксильных групп карбодиимидом при конденсации по С-копцевому карбоксилу [85], когда при последующей инкубации в щелочных условиях карбоксильные функции боковых цепей аминокислот превращаются в стабильные N-ацилмочевипы, а часть активированных С-концевых аминокислот— в реакциоиноспособные оксазолиноиы.

При обычных условиях активация пептида карбодиимидами приводит к конденсации его с носителем через карбоксильные

16.2. ТВЕРДОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ

445

группы боковых цепей пептида. В ходе дальнейшего определения последовательности аминокислот могут возникнуть пропуски последовательности в тех местах, где остатки карбоксил-содержащих аминокислот количественно присоединены к носителю за карбоксильные группы боковых цепей. Если данные-остатки не являются последними в цепи и за ними существуют другие точки присоединения к носителю, то определение структуры пептида можно продолжить. При конденсации в мягких условиях сохраняются свободные боковые карбоксильные группы некоторых внутренних остатков Asp или Glu. Известно много примеров анализа структуры пептидов, когда удавалось проводить идентификацию остатков Asp (Glu), расположенных внутри молекулы пептида и имевших свободные карбоксильные группы боковых цепей. Например, ТФ-методом определена аминокислотная последовательность большого числа таких коротких пептидов после их присоединения к амипополистиролу при рН 5,0 при помощи водорастворимого карбодиимида [67]. Эта методика основана на работе [109] с некоторыми доработками. Таким образом, проблему присоединения по боковым цепям в целом можно решать термодинамически и (или) статистически, тщательно регулируя выход на стадии конденсации пептида.

Описан усовершенствованный вариант присоединения белков к пористым стеклянным шарикам, активированным ДИТЦ [22].

В этой же работе предложена иммобилизация больших пептидов по остаткам His и Туг на диазотированных арилами-ноносителях или по остаткам Cys — на иодоацетамидирован-ных стеклянных шариках. Разработаны способы присоединения пептидов или промежуточных соединений, несущих аминогруппу, к носителю посредством сложноэфирной связи [14].

Иногда карбодиимиды используют в комбинации с активирующими добавками, способствующими образованию сложно-эфирной связи (например, N-гидроксисукцинимид или 1-гидр-оксибензотриазол) [1, 28, 64]. Быстрое образование активных сложных эфиров препятствует появлению неактивных N-ацилмочевин. Для обеспечения необхо

страница 69
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97

Скачать книгу "Практическая химия белка" (19.5Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы эксель выхино
приборы для газового отопления
recor
противопожарный клапан ppk-1-60 900х350

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)